Summary
Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis is een uitdaging, maar essentieel voor de patiëntenzorg. Dit microtiterplaat formaat biedt het testen van 12 antimycobacteriële drugs en zorgt voor minimale remmende concentratie (MIC) waarden, die zal helpen bij een passende behandeling.
Abstract
De snelle detectie van antimicrobiële resistentie is het belangrijk in het streven om de toename van resistente Mycobacterium tuberculosis (MTB) te controleren. Antimicrobiële gevoeligheid (AST) van de MTB is van oudsher uitgevoerd door de agar-methode van aandeel of door macrobroth testen op een instrument, zoals de BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) of BacT / ALERT (bioMerieux, Hazelwood, MO). De agar aandeel methode, terwijl beschouwd als de "gouden" standaard van AST, is arbeidsintensief en vereist de berekening van de weerstand door het uitvoeren van kolonie rekent op geneesmiddel-bevattende agar in vergelijking met drug-free agar. Als er ≥ 1% groei van de drug-bevattend medium in vergelijking met de drugs-vrij medium, wordt het organisme beschouwd als resistent tegen deze medicijnen. De macrobroth methoden vereisen instrumentatie en test break point ("kritische") concentraties van het geneesmiddel voor de eerste lijn geneesmiddelen (isoniazide, ethambutol, rifampicine en pyrazinamide). De hier beschreven methode is commercieel beschikbaar in een 96 wells microtiterplaat formaat [MYCOTB (TREK Diagnostics)] en bevat toenemende concentraties van 12 antibiotica voor de behandeling van tuberculose, waaronder zowel de eerste (isoniazide, rifampicine, ethambutol) en tweede lijn drugs (amikacine, cycloserine, ethionamide, kanamycine, moxifloxacine, ofloxacine, para-aminosalicylzuur, rifabutine, en streptomycine). Pyrazinamide, is een eerste lijn drugs en niet opgenomen in de microtiterplaat vanwege de noodzaak voor zure testomstandigheden. Voordelen van het systeem microtiter zowel het gemak van de set-up en een snellere doorlooptijd (14 dagen) in vergelijking met de traditionele agar deel (21 dagen). Daarnaast kan de plaat worden opgezet vanuit inoculum bereid met behulp van bouillon of vast medium. Sinds de microtiterplaat formaat is nieuw en sinds Mtb biedt unieke veiligheid uitdagingen in het laboratorium, dit protocol wordt beschreven hoe op een veilige manier instellen, broeden en lees de microtiterplaat.
Protocol
Elk laboratorium moet een risico-evaluatie in samenwerking met hun institutionele Biologische veiligheidsbeambte uit te voeren om de juiste bioveiligheidsniveau vast te stellen voor de voorbereiding van het inoculum en voor het pipetteren van het inoculum in de plaat. In ons laboratorium hebben we gebruik maken van bioveiligheidsniveau 3 laboratorium (BSL3) praktijken totdat de microtiterplaten zijn ingeënt, en verzegeld met een plastic zelfklevende afdichting. Deze platen worden dan geplaatst in een plastic zak, die warmte-ook verzegeld. Incubatie en de interpretatie lezing van de microtiterplaat wordt uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau twee laboratoria (BSL2).
1. Etikettering van materialen
- Label een bloed agar plaat, drie Middlebrook 7H10 platen, Middlebrook 7H9 bouillon, een zoute tussen glazen kraal buis en een microtiter AST plaat met de juiste kenmerken (zoals naam van de patiënt, medisch dossier nummer) in de BSL2.
- Label het bloed agar en 7H10 vergulde als "zuiverheid check '. Periodieke kiemgetal van het inoculum wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat een geschikte concentratie van organismen wordt gebruikt in de test. Kolonie telt wanneer deze wordt uitgevoerd zal moeten twee van de 7H10 platen gemerkt met "1 / 1 kiemgetal" en "1 / 50 kiemgetal" hebben.
2. Technoloog voorbereidingen te gaan in de BSL3
- De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen is noodzakelijk om het werk in de BSL3 en omvat solid-front gewaad, het hoofd te dekken, handschoenen, schoenen covers, en een masker. Elke instelling moet opzetten van hun eigen ademhalingsbescherming plan in samenwerking met industriële hun instelling Hygiëne Officer. In ons laboratorium hebben wij diverse maskers beschikbaar, waaronder aangedreven luchtzuiverende ademhalingstoestellen (PAPRs) en voorzien van HEPA-gefilterd, N95 half-face maskers.
3. Voorbereiding van de biologische veiligheid kabinet
- In de BSL3, de voorbereiding van de biologische veiligheid kast (BSC) met het desinfecteren van de oppervlakte en het plaatsen van een papieren handdoek doorweekt met een ontsmettingsmiddel ongeveer 6 centimeter van de ontluchter paneel.
- Plaats een afvalcontainer aan de linkerkant, en de kleine nephlometer en vortexer aan de rechterkant.
- Entogen, pipetors en tips worden geplaatst naast de papieren handdoek.
- Plaats een rek met het organisme (in bouillon of op vast medium) en de 0.5 McFarland standaard op de papieren handdoek.
4. Kalibratie van de nephelometer
- Plaats een zoutoplossing tussen glazen kraal buis in de nephelometer en zet het instrument op nul met behulp van het zoute tussen blank.
- Plaats de McFarland 0,5 standaard in de nephelometer en kalibreren volgens de instructies van de fabrikant.
5. Bereiding van het entmateriaal
- Werken in de BSC, schrapen kolonies van vast medium met een steriel oogje in het juiste label zoute tussen glazen kraal buis tot een ≥ 0,5 McFarland Standard is verkregen.
- Inspecteer het monster, en te vergelijken met de McFarland standaard.
- Vortex steekproef voor 30-60 seconden.
- Laat het inoculum genoegen te nemen met 15 minuten (een timer instellen).
6. Enten van de microtiterplaat
- Stel het inoculum met een zoutoplossing tussen bouillon met behulp van de nephelometer gekalibreerd om de McFarland 0,5 in stappen 4.1 en 4.2. Dit moet worden voltooid binnen 30 minuten (per specificaties van de fabrikant).
- Gebruik een 200 pi pipetter en een LONG spuitbus tegen pipet tip om 100 ul van inoculum uit de TOP 1 / 3 van de zoute kraal tussen buis. Inoculeren de Middlebrook 7H9 bouillon. Langzaam vortex de geïnoculeerde 7H9 bouillon gedurende 20 seconden.
- Verwijder de AST microtiterplaat uit de verpakking van de fabrikant. Niet gebruiken als het droogmiddel blauw is of als de folie verpakking beschadigd is.
- Bereid een 1:50 verdunning tube voor later gebruik bij de bereiding van de verdunning 1:50 eveneens 50 ul van steriel water in een steriele buis.
- Giet de bouillon 7H9 inoculum in een trog. VERMIJDEN het genereren van aërosolen.
- Plaats de AST microtiterplaat met het label naar u toe.
- Gebruik een 12-kanaals pipetter tot 100 pi van het inoculum toe te voegen aan elk putje.
- Bereid verdunningen voor kiemgetal:
- De 1 / 1 verdunning is bereid uit de positieve controle goed (H12) met strepen 1 ui lus op de 7H10 plaat het opschrift "1 / 1".
- De 1 / 50 verdunning wordt bereid door het enten een 1 pi lus van de positieve controle goed (H12) en wervelende het in de buis met 50 ul van water buis boven voorbereid. Streak een pi van deze verdunning aan de plaat het label "1 / 50".
- Inoculeren de zuiverheid platen uit de trog eveneens 50 ul op een juiste wijze gelabeld bloed agar en 7H10 plaat en strook voor isolatie.
- Plaatseen zelfklevende zegel op de AST microtiterplaat. Druk stevig op elk putje om voldoende afdichting te garanderen door gebruik te maken van de witte achterkant van het zegel. Te vermijden kreukels.
- Ontsmet de microtiterplaat schoon met een papieren handdoek doordrenkt met een tuberculocide ontsmettingsmiddel en plaats microtiterplaat in een plastic zak en sluit met een warmte-zegel of tape.
- De plastic zak dient als een secundaire container om ervoor te zorgen dat alle bouillon is opgenomen moet er een lek of morsing van de primaire plaat.
7. Desinfectie van materialen en biologische veiligheid kabinet
- Om te voorkomen dat de productie van spuitbussen, plaats een ander via op de top van de geïnoculeerde trog voordat u ze voorzichtig in de container gooi.
- Desinfecteer alle materialen inclusief nephlometer, vortexer, platen, buizen, enz. door vegen beneden met een tuberculocide ontsmettingsmiddel en wacht het juiste moment om desinfectie verzekeren volgens de instructies van de fabrikant voordat u van de BSC. Bijvoorbeeld Prospray, de tuberculocide desinfectiemiddel die we gebruiken, vereist 15 minuten om te doden mycobacteriën.
- Plaats de container gooi in een biohazard zak en sluit voor de autoclaaf.
8. Incubatie
- De platen worden geïncubeerd met de media naar beneden en zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat morsen of spatten een vloeistof.
- Incubeer de AST microtiterplaat plaat, 7H10 en bloed agar platen in een 35-37 ° C incubator met 5-10% CO 2 met 5-10% CO 2 in de BSL2 laboratorium.
- In ons laboratorium, is dit aanvaardbaar omdat de plaat is goed afgesloten en in een afgesloten plastic zak.
- Niet meer dan 2 microtiterplaten AST platen moeten worden gestapeld in de couveuse volgens de instructies van de fabrikant.
9. Representatieve resultaten
Interpretatie van de resultaten:Verzegelde AST microtiterplaten kan worden gelezen handmatig met een spiegel als een hulp of met een automatische plaat lezer, zoals de Vizion (TREK Diagnostics). De platen kunnen zo snel 7 dagen na inoculatie worden onderzocht. Onderzoekt de groei van controle putten in posities H11 en H12 om te bepalen of ze positief zijn (dwz, hebben een aanbetaling van cellen op de bodem van de put). Als de groei controle putten zijn niet positief, reincubate de plaat en op gezette tijden opnieuw te onderzoeken (bijvoorbeeld, dag 10, dag 14) tot de groei van controle putten zijn positief.
- Spiegel te lezen:
- Plaats verzegelde AST microtiterplaat op het platform;
- Lees de groei controle putten na 7 dagen incubatie, indien deze negatief is, reincubate AST microtiterplaat;
- Als de groei controles aanvaardbaar zijn, lees dan het medicijn-bevattende putten. Voor voor elk geneesmiddel, neem dan de eerste verdunning dat geen groei heeft door het vergelijken van de drug putten met de groei te controleren.
- Groei verschijnt als troebelheid of als borg van cellen op de bodem van een waterput.
- Instrument Lees: volg de instructies van de fabrikant, de onderstaande instructies zijn een voorbeeld van hoe de lezing zou worden gedaan met de Vizion platform:
- In te loggen
- Gebruik "MYCOTB" AST plaat software.
- Plaats verzegeld plaatje met de barcode naar de gebruiker. Groei verschijnt als troebelheid of als borg van cellen op de bodem van een waterput.
- Lees de groei controles; indien deze negatief is, reincubate AST microtiterplaat, als positief de plaat gelezen door het aanraken van het scherm met de eerste put van elk geneesmiddel dat niet tonen groei.
Lees zuiverheid platen. Het bloed agar plaat mogen geen groei na 48 uur en de 7H10 zuiverheid plaat moet samenvloeiing groei van een organisme type zijn. Indien verontreinigd, de AST microtiterplaten test moet worden herhaald vanuit een zuivere cultuur.
Bereken kiemgetal van de positieve controle en met behulp van de onderstaande tabel:
Kolonie Count Key
| # Kolonies geteld op het bord van het opschrift "1 / 1" | # Kolonies geteld op het bord van het label "1 / 50" | Inoculum Colony Count (cfu / ml) |
| <50 | 0 | <5 X 10 4 |
| 50-100 | 0-2 | 5 X 4 tot 01 oktober X 10 5 |
| > 100 | ≤ 10 | 1 x 10 5 tot 5 X 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 X 10 5 |
Er kunnen trailing met para-aminosalicylzuur in sommige stammen van Mycobacterium tuberculosissis. Dit kan worden geïnterpreteerd door te kijken naar alle putten die pellets hebben en het gebruik van de eerste put die dezelfde afmetingen heeft als pellet de volgende verdunning als het eindpunt. Weerstand is zeldzaam met dit geneesmiddel.
Figuur 1. Representatieve resultaten met behulp van de MYCOTB plaat.
| Drugs afkorting | Drug | MIC μ / ml |
| OFL | ofloxacine | 16 |
| MXF | moxifloxacine | 8 |
| RIF | rifampicine | > 16 |
| AMI | amikacine | 0.5 |
| STR | streptomycine | 16 |
| RFB | rifabutine | 8 |
| PAS | p-aminosalicylzuur | ≤ 0,5 |
| ETH | ethionamide | 5 |
| CYC | cycloserine | 4 |
| INH | isoniazide | 2 |
| KAN | kanamycine | 1.2 |
| EMB | ethambutol | 4.0 |
Discussion
Een voorbeeld van een AST microtiterplaat dat de positieve groei van de controles is weergegeven in figuur 1 en het eindpunt MIC (ug / ml) voor elk geneesmiddel is omcirkeld. Een studie uitgevoerd in ons laboratorium aangegeven dat de AST microtiterplaat methode is gelijkwaardig aan de gouden standaard agar aandeel methode voor het testen van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis. Snellere rapportage van de resultaten werd verkregen met microtiter AST microtiterplaat in vergelijking met de traditionele agar methode verhouding met de uiteindelijke interpretatie van AST microtiterplaat en agar proportie methode op 14 en 21 dagen, op respectievelijk AST microtiterplaat heeft het voordeel van het testen van de eerste en tweede lijn drugs tegelijk die kunnen helpen bij het voorkomen buitensporige vertragingen met resistente stammen. De AST microtiterplaat is ook veel makkelijker in te stellen en te lezen dan de APM en zowel een handmatige spiegel en een semi-geautomatiseerd systeem, zoals de Vizion kunnen worden gebruikt om de platen te lezen. De beschikbaarheid van een MIC-waarde voor de tbc-resistentie testen kunnen waardevolle nieuwe informatie aan artsen ten opzichte van de traditionele kritische concentratie waarde, vooral voor degenen isolaten met een "borderline" gevoeligheid.
Disclosures
Er is niets bekend te maken.
Acknowledgments
We willen graag naar het laboratorium technologen van de Mayo Clinic Mycobacteriologie Laboratorium bedanken voor hun hulp tijdens de studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
- Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).
- HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).
- Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing. Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).
- Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).
- SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. Product Insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).
- CLSI. Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).
- Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).
- VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. Product insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).
- Parrish, N. M., Carroll, K. C. The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings. J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).
- Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance. Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).
- Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).
- Bergmann, J. S., Woods, G. L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs. J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).
