Summary
Mycobacterium 결핵의 항균 자화율 시험에 도전하지만, 환자 치료를 위해 중요합니다. 이 microtiter 플레이트 형식 12 antimycobacterial 마약 테스트를 제공하며 적절한 치료에 도움이됩니다 최소 억제 농도 (MIC) 값을 제공합니다.
Abstract
항균 저항의 급속한 탐지 방지 Mycobacterium 결핵 (MTB)의 증가를 제어하기 위해 노력 중요합니다. MTB의 항균 자화율 테스트 (대서양 표준시)는 전통적으로 비례의 한천 방법으로 또는 / BACTEC (백톤 디킨슨, 스파크, MD), VersaTREK (트렉 진단, 클리블랜드, OH) 또는 BacT와 같은 악기에 macrobroth 테스트에 의해 수행되었습니다 알림 (bioMérieux, 하젤우드, MO). 고려하면서 한천 비례 방법은, AST의 "황금"표준은 집중적인 노동하고 마약없는 한천에 비해 약물이 포함된 한천에 식민지 카운트를 수행하여 저항의 계산이 필요합니다. 약물없는 매체에 비해 약물이 포함된 매체에 ≥ 1 % 성장이있다면, 유기체는 그 약물에 강한 것으로 간주됩니다. macrobroth 방법은 계측 및 첫 번째 라인 의약품에 대한 시험 브레이크 포인트 ( "중요한") 약물 농도를 (isoniazid, ethambutol, rifampin, 그리고 pyrazinamide)가 필요합니다. 방법은 96 잘 microtiter 플레이트 형식으로 상업적으로 사용할 수 있습니다 여기에 설명된 [MYCOTB (트렉 진단)]과 amikacin (둘 다 첫 번째 (isoniazid, rifampin, ethambutol)와 두 번째 라인 의약품을 포함한 결핵의 치료에 사용되는 12 antimicrobials의 증가 농도를 포함, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, 패러 aminosalicylic 산, rifabutin 및 스트렙토 마이신). Pyrazinamide, 첫 번째 라인 약물은 산성 시험 조건에 대한 필요로 인해 microtiter 접시에 포함되지 않습니다. microtiter 시스템의 장점 모두 설정의 용이성 전통 한천 비중 (21 일)와 비교하여 빠른 시간에 차례 (14 일) 등이 있습니다. 또한, 접시는 국물 또는 고체 매체 중 하나를 사용하여 준비 inoculum에서 설정할 수 있습니다. microtiter 접시 형식이 새로운과 MTB가 실험실에서 고유의 안전 문제를 제시 있기 때문에,이 프로토콜은 안전하게 설치하는 방법을 설명하기 때문에, 부화 및 microtiter 접시를 참조하십시오.
Protocol
각 실험실은 inoculum의 준비 및 접시에 inoculum의 pipetting에 해당 biosafety 수준을 결정하기 위해 그들의 기관 생물 안전 관리 책임자와 공동으로 위험 평가를 수행하기 위해 필요합니다. microtiter 접시가 주사, 플라스틱 접착 도장과 봉인까지 우리 연구실에서는, 우리 3 실험실 (BSL3) 사례 biosafety 수준을 사용합니다. 이 번호판은 다음 열을도 밀폐되어 비닐 봉지 안에 배치됩니다. microtiter 판의 배양과 해석 읽기는 biosafety 레벨 2 실험실 (BSL2)에 실시됩니다.
1. 자료의 라벨링
- 라벨 혈액 한천 플레이트 세 미들 7H10 접시, 미들 7H9 국물, 호수 트윈 유리 비드 튜브와 BSL2 해당 식별자 (예 : 환자 이름, 의료 기록 번호)와 대서양 표준시 microtiter 접시.
- 라벨 혈액 한천 배지와 "순도 검사"로 도금 7H10. inoculum 정기적으로 식민지 카운트는 생물의 적절한 농도가 테스트에 사용하도록 권장합니다. 수행 콜로니 카운트는 "1분의 1 콜로니 개수"와 "50분의 1 식민지 개수"로 표시된 7H10 접시 두 가지가 필요합니다.
2. BSL3로 이동 기술자 준비
- 적절한 개인 보호 장비는 BSL3에서 작업하는 데 필요한이며 솔리드 앞에 가운, 머리 커버, 장갑, 신발 커버, 그리고 인공 호흡기가 포함되어 있습니다. 각 기관들은 기관의 산업 위생 관리 책임자와 공동으로 자신의 호흡기 보호 계획을 수립해야합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 전원이 공급되는 공기 정화 호흡기 (PAPRs) 및 장착 HEPA - 필터링, N95 절반 얼굴 호흡기를 포함하여 사용 가능한 여러 가지 호흡기를했습니다.
3. 생물 학적 안전 캐비닛의 준비
- BSL3에서 표면을 소독하고 공기 패널에서 살균제 약 6인치로 적셔 종이 타월을 배치하여 생물 학적 안전 캐비닛 (BSC)를 준비합니다.
- 폐기물 왼쪽 용기, 그리고 오른쪽에 작은 nephlometer 및 vortexer를 놓습니다.
- Inoculating 루프, pipetors 및 도움말은 종이 타월 옆에 배치됩니다.
- 유기체 (국물 또는 고체 매체에)와 종이 타월에 맥팔랜드 0.5 표준 랙에 넣으십시오.
4. nephelometer의 보정
- nephelometer 호수 트윈 유리 구슬 튜브를 삽입하고 생리 트윈 공백을 사용하여 0으로 악기를 설정합니다.
- nephelometer에 맥팔랜드 0.5 표준을 놓고 제조 업체의 지침에 따라 보정.
5. Inoculum의 준비
- ≥ 0.5 맥팔랜드 표준 얻을 때까지 적절하게 표시된 호수 트윈 유리 비드 관에 멸균 루프를 사용하는 고체 배지에서 BSC, 스크 레이프 식민지에서 근무.
- 시각 샘플을 검사하고, 맥팔랜드 표준 비교합니다.
- 30-60초을위한 와동 샘플.
- (타이머 설정) 15 분 정착 inoculum하실 수 있습니다.
6. microtiter 접시의 접종
- 단계 4.1 및 4.2 맥팔랜드 0.5 보정 nephelometer를 사용하여 살린 트윈의 국물로 inoculum를 조정합니다. 이것은 30 분 (당 제조 사양) 이내에 완료해야합니다.
- 200 μL pipetter과 살린 비드 트윈 튜브의 TOP 3분의 1 차에서 inoculum 100 μL를 제거하는 데 오랜 에어로졸 방지 pipet 팁을 사용합니다. 미들 7H9의 용기를 예방. 천천히 와동 20 초 동안 주사 7H9 국물.
- 제조 업체의 패키지에서 대서양 표준시의 microtiter 플레이트를 제거합니다. 박 패키지가 손상된 경우 건조은 파란색 또는 경우 사용하지 마십시오.
- 멸균 튜브에 멸균 물의 50 μL를 pipetting하여 1시 50분 희석의 준비에 나중에 사용하기 위해 1시 50분 희석 튜브를 준비합니다.
- 신중하게 여물로 7H9 국물의 inoculum 잔. 에어로졸을 생성하지 마십시오.
- 당신이 직면하고있는 레이블로 대서양 표준시의 microtiter 접시를 놓습니다.
- 각각 잘 수있는 inoculum 100 μL를 추가하는 12 채널 pipetter을 사용합니다.
- 식민지 카운트에 대한 dilutions 준비 :
- 1분의 1 희석는 "1분의 1"이라는 7H10 판 1 μl 루프를 줄이하여 잘 긍정적인 컨트롤 (H12)에서 준비가되어 있습니다.
- 50분의 1 희석이 잘 긍정적인 컨트롤 (H12)에서 1 μl 루프를 inoculating 이상 준비 수관 50 μl와 튜브에 그것을 소용돌이로 준비가되어 있습니다. 번호판이 희석의 리크 1 μL은 "50분의 1"(으)로 분류.
- 적절하게 레이블이 붙은 혈액 한천과 7H10 플레이트 및 격리를위한 행진에 50 μL를 pipetting하여 여물에서 순도 접시의 예방.
- 장소대서양 표준시의 microtiter 플레이트에 접착제 인감. 인감의 백색 다시를 사용하여 충분한 씰링을 보장하기 위해 각 자에 단단히 누르십시오. 주름을 피하십시오.
- 열 인감 또는 테이프와 비닐 봉지와 가까이에 tuberculocidal 방역 및 장소 microtiter 플레이트로 적셔 종이 타월로 닦아하여 microtiter 접시를 소독.
- 비닐 봉투가가 기본 접시의 누출 또는 유출되어야 모든 국물이 들어 있는지 확인하기 위해 보조 컨테이너 역할을합니다.
7. 자료와 생물 학적 안전 캐비닛의 살균
- 에어로졸 생산을 방지하기 위해 폐기 용기에 넣어 부드럽게하기 전에 주사 여물 위에 또 다른 여물을 놓으십시오.
- tuberculocidal 살균제로 닦고하여 nephlometer, vortexer, 접시, 튜브 등 모든 자료를 소독하고 BSC에서 제거하기 전에 제조 업체의 지시에 따라 소독을 확보하기 위해 적절한 시간을 기다립니다. 예를 들어, Prospray 우리가 사용하는 tuberculocidal 살균제는 mycobacteria 죽일 15 분 필요합니다.
- autoclaving 전에 생물 학적 가방 날인의 폐기 컨테이너를 놓습니다.
8. 잠복
- 플레이트는 아래 미디어 incubated되어야하며 치료는 어떤 액체를 흘리고 또는 물 튀기지 않도록 주의해야한다.
- BSL2 연구실에 50-10%의 CO 2 5~10%의 CO 2와 35-37 ° C 배양기에서 대서양 표준시의 microtiter 플레이트 판, 7H10과 혈액 한천 플레이트를 품어.
- 접시 잘 밀봉하여 내부 봉인된 비닐 봉지이기 때문에 저희 연구실에서는이 허용됩니다.
- 더 이상 2보다 microtiter 대서양 표준시 플레이트는 제조 업체의 지침에 따라 보육에 쌓아해야합니다.
9. 대표 결과
결과의 해석 :실드 대서양 표준시 microtiter 접시 수동 지원 또는 Vizion (트렉 진단) 등의 자동 플레이트 리더와 함께 거울을 사용하여 읽을 수 있습니다. 접시는 즉시 접종 후 칠일로 검사하실 수 있습니다. 그들은 (예, 잘 하단의 세포의 보증금을 가지고) 긍정적인 있는지 확인하기 위해 위치 H11와 H12의 성장 제어 우물을 검사합니다. 성장 제어 우물이 긍정적하지 않는 경우, 접시를 reincubate 및 성장 제어 우물은 긍정 때까지 (예, 하루 10, 일 14) 정기적으로 다시 검사하십시오.
- 미러 읽기 :
- 장소는 플랫폼에 대서양 표준시 microtiter 접시를 봉인;
- 배양 7 일 후 성장 제어 우물을 읽고, 이것은 부정, reincubate 대서양 표준시 microtiter 접시 경우;
- 성장 컨트롤이 허용하는 경우, 다음 약물이 포함된 우물을 참조하십시오. 각 약물에 대한 내용은 성장 컨트롤과 함께 마약 우물을 비교하여 더 성장이없는 최초의 희석을 기록합니다.
- 성장 탁도 또는 우물의 하단에있는 세포의 보증금으로 나타납니다.
- 악기 읽기 : 제조 업체의 지침을 따르십시오, 아래의 지침은 읽기가 Vizion 플랫폼과 할 것입니다 방법에 대한 예제입니다
- 로그인
- "MYCOTB"대서양 표준시 플레이트 소프트웨어를 사용합니다.
- 사용자가 직면하고있는 바코드와 함께 밀봉 플레이트를 놓습니다. 성장 탁도 또는 우물의 하단에있는 세포의 보증금으로 나타납니다.
- 성장 컨트롤을 읽고, 이것은 부정, reincubate 대서양 표준시 microtiter 접시 경우, 긍정적인 성장을 표시하지 않는 각 약물의 첫 잘으로 화면을 감동하여 번호판을 읽으면.
순도 번호판을 읽어 보시기 바랍니다. 혈액 한천 플레이트 48 시간 이후에는 성장을 보여주지해야하며 7H10 순도 판 하나의 유기체 유형의 합류 성장이 있어야합니다. 오염된 경우에는 대서양 표준시 microtiter 테스트는 순수한 문화에서 반복해야합니다.
물론 아래의 테이블을 사용하여 긍정적인 컨트롤에서 콜로니 수를 계산 :
콜로니 카운트 키
| # 식민지는 "1분의 1"(으)로 분류 접시에 계산 | # 식민지는 "50분의 1"(으)로 분류 접시에 계산 | Inoculum 콜로니 개수 (cfu / ML) |
| <50 | 0 | <5 X 10 4 |
| 50-100 | 0-2 | 5 X 10월 4일에서 1일까지 X 10 5 |
| > 100 | ≤ 10 | 1 X 10월 5일부터 5일까지 X 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 X 10 5 |
Mycobacterium tuberculo의 일부 변종의 패러 aminosalicylic 산성과 함께이 후행 수 있습니다언니. 이 알약을 모든 우물을보고하고 끝점으로 다음 희석 같은 크기 펠렛을 가지고 처음으로 잘 사용하여 해석될 수있다. 저항이 약물로 드문 경우입니다.
그림 1. MYCOTB 플레이트를 사용하는 대표적인 결과.
| 약물 약어 | 마약 | 마이크 μ / ML |
| OFL | ofloxacin | 16 |
| MXF | moxifloxacin | 8 |
| RIF | rifampin | > 16 |
| AMI | amikacin | 0.5 |
| STR | 스트렙토 마이신 | 16 |
| RFB | rifabutin | 8 |
| PAS | P - aminosalicylic 산성 | ≤ 0.5 |
| ETH | ethionamide | 5 |
| CYC | cycloserine | 4 |
| INH | isoniazid | 2 |
| KAN | kanamycin | 1.2 |
| EMB | ethambutol | 4.0 |
Discussion
긍정적인 성장 컨트롤을 가진 대서양 표준시의 microtiter 접시의 예제는 그림 1에 나와 있으며, 각각의 약물에 대한 끝점 MIC (μg / ML)이 돌고있다. 우리 연구실에서 수행 연구는 대서양 표준시의 microtiter 플레이트 방법은 Mycobacterium의 결핵의 자화율 시험을위한 황금 표준 한천 비중 방법에 해당하는 것을 지적했다. 대서양 표준시 microtiter 플레이트와 한천 비율 방법 14에서 21 일 동안 최종 해석 전통 한천 비율 방법과 비교하여 결과의 빠른보고가 microtiter 대서양 표준시 microtiter 플레이트와 함께 얻은 것입니다, respectively.The 대서양 표준시 microtiter 플레이트 먼저 테스트의 장점을 가지고 있으며, 두번째 라인 모성 종자와 과도한 지연을 방지할 수 있습니다 동시에 마약. 대서양 표준시 microtiter 접시 또한 APM보다 설정과 읽기 훨씬 쉽게와 같은 VIZION 같이 수동으로 거울과 세미 자동화 시스템 모두는 접시를 읽는 데 사용할 수 있습니다. 결핵 약제 내성 검사에 대한 MIC 값이 있는지의 여부는 특히 "경계선"자화율있는 사람 격리를 위해, 전통적인 중요한 농도 값에 비해 의사들에게 유용한 새로운 정보를 제공할 수 있습니다.
Disclosures
공개 아무것도 없습니다.
Acknowledgments
우리는 공부하는 동안 그들의 도움을 메이오 클리닉 Mycobacteriology 연구소의 실험실 기술자에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
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