Microfabbricazione post-Array-Detector (mPADs): un approccio per isolare le forze meccaniche

Summary

In questo video ci dimostra come fabbricare e utilizzare microfabbricazione rivelatori gamma post (mPADs) per valutare modulazioni della contrattilità cellulare.

Abstract

In questo video, presenteremo il nostro approccio per misurare le forze di trazione cellulare utilizzando una matrice microfabbricazione di messaggi. Forze di trazione vengono generati tramite interazioni actina-miosina e svolgono un ruolo importante nella nostra fisiologia. Durante lo sviluppo, che permettono alle cellule di spostarsi da un luogo all'altro per formare le strutture primi di tessuto. Forze di trazione aiuta nei processi di guarigione. Essi sono necessari per la corretta chiusura di ferite o la migrazione e la scansione dei leucociti attraverso il nostro corpo. Queste stesse forze possono essere dannosi per la nostra salute in caso di metastasi del cancro o di crescita vascolare verso un tumore. Il metodo più comune con cui studiare le cellule in vitro è stato quello di usare un bicchiere o un piatto di polistirolo. Tuttavia, la rigidità dei substrati rende fisicamente impossibile misurare le forze di trazione delle cellule, e ci sono metodi relativamente pochi per studiare le forze di trazione. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica per superare queste limitazioni. Il metodo si basa su un array verticale di cantilever flessibili, la rigidità e la scala di dimensioni tali che le singole cellule sparse cantilever molti e deviare nel processo. I pilastri che utilizziamo sono 3 micron di diametro, alto 10 micron, e sono configurati in una serie regolare con 9 micron da centro a centro spaziatura. Ma queste dimensioni fisiche possono essere facilmente variata per ospitare una varietà di studi. Si comincia con un master al silicio, ma i pali finali sono realizzati in gomma di silicone chiamato poli (dimetil silossani) o PDMS. Siamo in grado di misurare la deviazioni sotto un microscopio e calcolare l'entità e la direzione delle forze di trazione necessaria per produrre le deformazioni osservate. Noi chiamiamo questi substrati microfabbricazione post-array-detector, o mPADs. Qui, vi mostreremo come fabbricare e usare il mPADs per valutare modulazioni della contrattilità cellulare.

Protocol

Silicon Maestro Mold Fabrication

Litografia

Materiali:

• 75 wafer di silicio millimetri
• SU-8 2 Fotoresist negativo (MicroChem, Boston, MA)
• N2

Metodo:

1. Disidratare wafer di silicio a 120 ° C per 2 ore.
2. UV trattamento superficiale di ozono per 7 minuti per rimuovere sostanze organiche.
3. Superficie colpo N2 per rimuovere il particolato.
4. Applicare SU-8 2 per coprire il 70% della superficie (~ 10 ml per 75 wafer mm).
5. Rotazione a 2000 giri per 20 secondi con 300 giri di accelerazione / s.
6. Posizionare la cialda su una piastra e rampa da temperatura ambiente a 95 ° C.
7. Softbake il photoresist per 15 minuti a 95 ° C.
8. Flood esporre wafer per 20-25 mJ/cm2 dosi a 365 nm (I-line) per formare lo strato inferiore.
9. Applicare SU-8 2 per strato fotosensibile secondo.
10. Girare a 550 giri per 20 secondi con 300 giri di accelerazione / s per un film di circa 11 micron di spessore.
11. Posizionare la cialda su una piastra e rampa da temperatura ambiente a 65 ° C.
12. Softbake il wafer a 65 ° C per 5 minuti.
13. Rampa la piastra da 65 ° C a 95 ° C.
14. Softbake il wafer per 55 minuti a 95 ° C.
15. Wafer raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti.
16. Allineare maschera mPAD su wafer ed esporre per 95-100 mJ/cm2 dosi a 365 nm (I-line).
17. Posizionare la cialda su una piastra e rampa da temperatura ambiente a 95 ° C.
18. Post-esposizione del photoresist cuocere per 25 minuti a 95 ° C.

Sviluppare

Materiali:

• Piatti di vetro 100mm (5)
• Glicole propilenico etere acetato di metile (PGMEA)
• Isopropanolo (IPA)
• N2

Metodo:

1. In una cappa chimica, riempire cinque piatti con PGMEA (2), IPA, e Esano (2).
2. Tenere wafer in 1a PGMEA per 10 secondi
3. Agitare wafer per 50 secondi
4. Trasferimento wafer al 2 PGMEA con menisco di PGMEA.
5. Agitare per 5 secondi.
6. Trasferimento wafer di IPA con menisco di PGMEA.
7. Agitare per 20 secondi.
8. Trasferimento wafer al 1 ° IPA.
9. Agitare per 5 secondi.
10. Trasferimento wafer di IPA 2.
11. Agitare per 5 secondi.
12. Rimuovere rapidamente wafer da IPA 2 ° con menisco di IPA e asciugare con N2
13. Ispezionare modello.
14. Hardbake wafer a 120 ° C per 14-20 ore per cross-link SU-8.
15. Dice il wafer con un tagliatore di diamanti
16. Montare il wafer su un vetrino con resina epossidica
17. Fluorosilanize il wafer (vedi istruzioni in stampaggio replica)

Stampaggio replica di mPADS

Stampo negativo

Materiali:

• Alluminio usa e getta di peso barca
• Polidimetilsilossano (PDMS), base e catalizzatore (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Silano: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-triclorosilano
• Vetrini
• Pipetta Pasteur in vetro

Metodo:

1. Mescolare PDMS 10:01 in peso e Degas in sottovuoto per 1 ora per rimuovere le bolle.
2. Luogo maestro stampo in silicone in barca alluminio.
3. Versare 50-60 g di PDMS oltre stampo master in barca alluminio.
4. Degas sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle.
5. Blow off superficie bolle d'aria intrappolate nel PDMS con rapido colpo di N2.
6. Posto barca nel forno ventilato a 110 ° C per 15 minuti fino a PDMS è fermo.
7. Tagliare barca di alluminio.
8. Con la lametta, troncare PDMS silicio sotto padrone.
9. Sbucciare PDMS lontano dal maestro silicio lentamente e con movimento continuo in una direzione per evitare di distruggere il maestro.
10. Ispezionare maestro silicio per danni.
11. Tagliare stampo negativo in 4 pezzi.
12. Ripetere i passaggi 1-10 per una grande serie di stampi in negativo.
13. Plasma di ossigeno trattare stampo negativo per 1,5 minuti per attivare superficie, o
14. L'ozono trattare stampo negativo per circa 10 minuti per attivare la superficie.
15. Mettere gli stampi in negativo essiccatore con caratteristiche mPAD esposti.
16. Diffusione 250-500 ml di silano su vetrino nel centro di essiccatore
17. Luogo pascolo pipetta di vetro con 150-200 ml di silano nella punta all'interno essiccatore.
18. Camera a vuoto per far evaporare stampi negativi silani e cappotto per> 14 ore.

mPADS

Materiali:

• Polidimetilsilossano (PDMS), base e catalizzatore (Dow, Midland, MI)
• Bocca larga pipette usa e getta
• 2 "x 3" Glass diapositive
• Vetro Scribe
• N2

Metodo:

1. Mescolare PDMS 10:01 in peso e Degas in sottovuoto per 1 ora per rimuovere le bolle.
2. pizzo silanizzata stampi negativi in ​​'croce'
3. Pipettare PDMS in stampi negativo in modo che le caratteristiche sono interamente coperti da uno spessore 1mm.
4. Attendere 30 minuti per eventuali bolle d'aria nel PDMS a salire in superficie. </ Li>
5. In 30 'i tempi di inattività, la polvere 22x22mm (n. 2) coprioggetto di vetro con un flusso di N2.
6. Ossigeno nel plasma vetrini trattare metà per 1,5 minuti per pulire e attivare vetro
7. Blow off superficie bolle d'aria intrappolate nel PDMS con rapido colpo di N2.
8. Addagiate bordo del vetro coprioggetto sul PDMS con il lato pulito di fronte al plasma PDMS. Abbassare lentamente il vetrino in modo che il pieno PDMS contatti su tutta la superficie di vetro e di evitare bolle d'aria intrappolati sotto il vetrino.
9. Luogo assemblati stampi in forno ventilato a 110 ° C per 20 ore per curare completamente.
10. Togliere gli stampi da forno e lasciarli raffreddare a RT.
11. Tenere vetrino con una mano sopra e lentamente buccia negativo via lo stampo negativo dal basso per liberare il mPAD.
12. Ispezionare la mPAD sotto un microscopio per i post è crollato.
13. Re-silanize stampo tramite il plasma e silano ogni quattro getti. La durata dello stampo negativo per la replica è di circa 6-20 buon cast.

Cellule semina su mPADS

Stampigliatura

Materiali:

• PDMS francobolli per UCP (vedi Tien, J & Chen, CS, in Metodi di Ingegneria dei Tessuti, 2001, pp 113-120).
• Etanolo (100% e 70%)
• Sterilizzati acqua deionizzata
• 50 ug / ml fibronectina umani in acqua deionizzata sterile (BD Biosciences)
• 5 ug / ml soluzione DII filtrata con membrana 0,2 micron (D-3886, Molecular Probes, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey)
• 1X fosfato soluzione tampone.
• 100 mm x 25 millimetri scatola di Petri (4)
• 150 millimetri x 25 mm scatola di Petri (2)
• Foglio di alluminio
• N2
• Pinzetta
• Cappuccio sterile

Metodo:

1. Trim PDMS eccesso mPADs
2. Se il timbro PDMS è stata utilizzata in precedenza, sonicare francobolli in etanolo 100% per 5 minuti a macchia di distanza proteine ​​contaminanti.
3. Nel cappuccio sterile, tenere timbri su un fianco con le pinzette e asciugare con N2 dopo immersione in acqua dolce francobolli etanolo al 100% e acqua sterile
4. Luogo in 150 millimetri piatto di Petri con il lavoro verso l'alto.
5. Aliquota gocce di soluzione fibronectina su ogni francobollo. Inizia con gli angoli in ciascuno dei francobolli, poi i bordi, e infine le regioni interne. Inizialmente la superficie PDMS del francobollo è idrofobica, ma diventa idrofile come la proteina viene adsorbito. Lavoro "dall'esterno all'interno" cambia l'angolo di contatto del PDMS in modo che un minor volume di soluzione fibronectina è necessaria per mano completamente il timbro.
6. Lasciate riposare per 1 ora nel cappuccio per delle proteine.
7. Lavare con acqua deionizzata francobolli versando nel piatto e lasciando che il livello dell'acqua sale sopra i francobolli.
8. Lavare i francobolli in 100 millimetri piatto di Petri riempite con acqua deionizzata.
9. Rimuovere e secco con N2.
10. MPADS ozono per il trattamento di 7 minuti per attivare la superficie per la timbratura.
11. Sotto il cofano, timbro mPADS mettendo bordo timbro sulla mPAD e delicatamente abbassare di entrare in contatto pieno. Toccare leggermente la parte superiore del francobollo con pinzette per garantire tutte le aree hanno un buon contatto, ma attenzione a non comprimere il post.
12. Rimuovere con attenzione i francobolli con le pinzette.
13. MPADS immergere in 100 millimetri piatto di Petri con il 100% di etanolo per ~ 15 secondi. Tenere microaghi da dewetting durante il trasferimento con il trasferimento in fretta tra i piatti.
14. MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con etanolo al 70% per ~ 15 secondi.
15. MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi.
16. MPADS immergere nel secondo piatto 100 millimetri di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi.
17. MPADS immergere in 150 millimetri piatto di Petri con acqua deionizzata.
18. MPADS immergere in 150 millimetri piatto di Petri con 100 mL di soluzione DII.
19. Coprire con un foglio di alluminio e di ammollo per 1 ora.
20. MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi.
21. MPADS immergere in 150 millimetri piatto di Petri con 10 ml del 2% Pluronics e 90 ml di PBS per la concentrazione totale del 0,2% Pluronics.
22. Coprire e ammollo per 1 ora.
23. MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi.
24. MPADS immergere nel secondo piatto 100 millimetri di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi.
25. MPADS immergere in terza piatto 100 millimetri di Petri con PBS per ~ 15 secondi.

Semina

Materiali:

• Linea cellulare scelto
• Tripsina-EDTA (0,25% tripsina con EDTA • 4NA, Cat. Gibco. No. 25200-056)
• Crescita media
• 1X fosfato soluzione tampone.

Metodo:

1. Nel cappuccio sterile, mPADS posto in piatto mm 100 petri e riempite con 17 ml di mezzo.
2. Luogo Petri in incubatore per scaldare a 37 ° C
3. Sospendere le cellule tramite tripsina
4. Aspirare ripetutamente di rompere gruppi di cellule.
5. Pipettare sospensione cellulare nella capsula di Petri con il mPADS. Aggiungi tali cellule rimarranno singole cellule (senza cellula-cellula contatti) al momento dell'analisi. L'esatta quantità di cellule da aggiungere è cellule di tipo specifico edipende dalla superficie delle cellule diffusione e tasso di crescita.
6. Delicatamente le cellule si disperdono in capsula di Petri con pippetting lento.
7. Posto in incubatrice per 2 ore per permettere alle cellule di stabilirsi e di aderire su microaghi.
8. Ispezionare mPADS per vedere se le cellule si sono diffuse. Le cellule appiattite e sarà durata sei o più messaggi.
9. Se le cellule sono distribuite, il trasferimento mPADS di nuovo 100 millimetri piatto di Petri con 21 ml di terreno fresco.
10. Il mPADS sono pronti per l'esperimento.

Colorazione e montaggio mPADS

Fissaggio

Materiali:

• Acqua deionizzata
• Paraformeldahyde (16%) fiala
• 10X fosfato soluzione tampone.
• 1X fosfato soluzione tampone.

Metodo:

1. In un tubo di centrifuga 50 mL, aggiungere 30 ml di DI, 10 ml di paraformeldahyde (fiala intera), e 4,5 ml di PBS 10X per la soluzione di fissaggio.
2. Aggiungi ~ 25 mL di soluzione di fissaggio per un piatto di 100 mm di Petri.
3. MPAD immergere delicatamente con le cellule di fissaggio in piatto e lasciare incubare per 20 minuti.
4. MPADS immergere in 100 mm con piatto 1X PBS per tre volte.
5. Pronto per immunostaining e montaggio.

Analizzando Forze cellulare sul mPADS

Confocale Imaging

Materiali:

• Microscopio confocale
• Obiettivo 63x
• Cubetti di filtro per gli anticorpi secondari
• Filtro verde cubo (Rhodamine) per l'imaging di DII microaghi.

Metodo:

1. MPADs posto sul palco e trovare singole cellule con 300 ms di esposizione, senza binning.
2. Cime immagine di microaghi per IMAGE TOP.
3. Usando z-controllo lettura, dell'immagine di microaghi per immagine in basso.
4. Immagine tutti gli altri canali che avete a macchie (Hoechst, falloidina ecc)

Analisi dell'immagine

Materiali:

• MATLAB con Image Processing Toolbox

Metodo:

1. Ruota e registrare le immagini superiore e inferiore
2. Centroidi di misura inferiore (undeflected) e superiore (deviato) le posizioni
3. Calcolare lo spostamento
4. Utilizzando la costante della molla per i posti (noto, dipende dalla geometria del post), calcolare vettore forza ad ogni messaggio
5. Analisi degli errori è basata sulla capacità di risolvere le forze, e dipende dalla risoluzione dell'immagine e la risoluzione di rilevamento centroide
6. Organizzare i dati secondo i vostri bisogni personalizzati - per esempio, grandezze forza e / o direzione, come un corso di tempo, molte misure diverse per le varie patologie, ecc