Microfabricated 포스트 - 배열 감지기 (mPADs) : 기계적 힘을 분리하는 접근

Summary

이 비디오에서는, 우리는 세포의 수축성 modulations을 평가하기 microfabricated 게시 배열 검출기를 (mPADs) 조작하고 활용하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

이 비디오에서는, 우리는 게시물 microfabricated 배열을 사용하는 셀룰러 견인 세력을 측정하는 접근을 제시합니다. 견인 세력은 마이 오신 - 굴지의 상호 작용을 통해 생성 및 생리학에 중요한 역할을하고 있습니다. 개발하는 동안, 그들은 세포 조직의 초기 구조를 형성 한 위치에서 순서대로 다음으로 이동할 수 있습니다. 견인 세력은 치유 과정에 도움이됩니다. 그들은 상처의 적절한 폐쇄 또는 신체를 통해 마이 그 레이션 및 leukocytes의 크롤 링을 위해 필요합니다. 이 같은 군대는 암 전이 또는 종양으로 혈관 성장의 경우 우리의 건강에 해로운 수 있습니다. 체외에서 세포를 공부하는 가장 일반적인 방법은 유리 또는 폴리스티렌 접시를 사용하도록되었습니다. 그러나 기판의 강성은 불가능 물리적 셀 견인 세력을 측정하게하고, 견인 세력을 연구하기 위해 상대적으로 몇 가지 방법이 있습니다. 우리 연구실은 이러한 한계를 극복하기 위해 기술을 개발했습니다. 방법은 각 세포가 여러 cantilevers 전역과 그 과정에서 그들을 비켜 이러한되어있는 유연한 cantilevers, 강성과 크기 규모의 수직 배열을 기반으로합니다. 우리가 사용하는 기둥은 10 μm의 높이 직경 3 μm의, 있으며, 9 μm의 중심 - 투 - 중심 간격과 일반 배열에 구성됩니다. 하지만 이러한 물리적 치수는 쉽게 연구의 다양한 수용 다양한 수 있습니다. 우리는 실리콘 마스터로 시작하지만, 최종 게시물은 실리콘 고무 (디메틸 실록산) 폴리, 또는 PDMS라는 밖으로 만들어집니다. 우리는 현미경 deflections을 측정하고 관찰 deflections를 생성하는 데 필요한 견인 세력의 크기와 방향을 계산할 수 있습니다. 우리는이 기판은 이후 배열 탐지기, 또는 mPADs을 microfabricated 전화. 여기, 우리는 세포의 수축성 modulations을 평가할 수 mPADs를 조작하고 사용하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

실리콘 마스터 몰드 제작

리소그래피

자료 :

• 75mm 실리콘 웨이퍼
• SU - 8 2 마이너스 포토 레지스트 (Microchem, 보스톤, MA)
• N2

방법 :

1. 2 시간 동안 120 ° C에서시 웨이퍼를 탈수.
2. 7분에 대한 UV 오존 처리의 표면은 유기물을 제거합니다.
3. N2 블로우 표면은 입자를 제거합니다.
4. 적용 SU - 8을 표면의 70 % (75mm 웨이퍼를위한 ~ 10 ML) 커버 2.
5. 300 RPM / s의 가속도와 함께 20 초 동안 2,000 rpm으로 회전.
6. 95 ° C.에 실온에서 열판과 진입로에있는 웨이퍼 플레이스
7. 95 15 분 동안 포토 레지스트를 Softbake ° C.
8. 홍수가 20 웨이퍼를 노출 - 25 mJ/cm2 복용량을 365 nm의 (I - 라인) 하단에 레이어를 형성합니다.
9. 적용 SU를 8초 포토 레지스트 레이어 2.
10. 약 11 μm의 두께 필름 300 RPM / s의 가속도와 함께 20 초 동안 550 rpm으로 회전.
11. 65 ° C.에 실온에서 열판과 진입로에있는 웨이퍼 플레이스
12. ° C 5 분 65 웨이퍼를 Softbake.
13. 65에서 열판 램프 ° C 95 ° C.
14. 95에서 55분 위해 웨이퍼를 Softbake ° C.
15. 20 분 상온에 쿨 웨이퍼.
16. 웨이퍼에 mPAD 마스크를 정렬 및 95에 대한 노출 - (I - 라인) 365 nm의 100 mJ/cm2 복용량.
17. 95 ° C.에 실온에서 열판과 진입로에있는 웨이퍼 플레이스
18. 포스트 - 노출 95 25 분 동안 포토 레지스트를 구워 ° C.

개발

자료 :

• 100mm 유리 요리 (5)
• 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)
• 이소프로판올 (IPA)
• N2

방법 :

1. 화학 후드에서 PGMEA (2), IPA, 그리고 헥산 (2) 5 개 요리를 입력합니다.
2. 10 초 첫번째 PGMEA에서 웨이퍼를 개최
3. 50 초만 웨이퍼 선동
4. PGMEA의 초승달 모양과 둘째 PGMEA에 웨이퍼를 전송합니다.
5. 5 초 동안 선동.
6. PGMEA의 초승달 모양과 IPA에 웨이퍼를 전송합니다.
7. 20 초 동안 선동.
8. 첫째 IPA에 웨이퍼를 전송합니다.
9. 5 초 동안 선동.
10. 둘째 IPA에 웨이퍼를 전송합니다.
11. 5 초 동안 선동.
12. 신속 IPA의 초승달 모양과 둘째 IPA에서 웨이퍼를 제거하고 N2와 건조
13. 패턴을 검사합니다.
14. 120 ° C 14~20시간시키기위한 상호 연결 SU - 8에서 편도를 넣은 설탕 과자 웨이퍼.
15. 다이아몬드 커터로 웨이퍼를 다이스
16. 에폭시를 사용하여 유리 슬라이드에 웨이퍼 마운트
17. (복제 성형의 지침을 참조) 웨이퍼를 Fluorosilanize

mPADS의 복제 성형

마이너스 몰드

자료 :

• 보트 무게 일회용 알루미늄
• Polydimethylsiloxane (PDMS) 기본 및 치료 에이전트 (다우, 미들랜드, MI)
• Razorblade
• 실란 (tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahyrooctyl) - 1 - trichlorosilane
• 유리 슬라이드
• 유리 파스퇴르 피펫

방법 :

1. 거품을 제거하는 1 시간 진공 미만의 무게와 데가스하여 PDMS 10시 1분를 섞습니다.
2. 알루미늄 보트에 넣어 실리콘 마스터 금형.
3. 50 붓고 - 알루미늄 보트 마스터 몰드를 통해 PDMS의 60g 있습니다.
4. 거품을 제거하는 30 분 진공하에 데가스.
5. N2의 빠른 폭발과 PDMS의 표면 갇힌 기포를 날려.
6. 110 대류 오븐에 넣어 보트는 ° C 15 분 동안 PDMS는 기업 때까지.
7. 알루미늄 보트를 버려야.
8. razorblade로 실리콘 마스터 아래 PDMS 멀리 트림.
9. 멀리 실리콘 마스터에서 필 PDMS는 천천히 한 방향으로 지속적인 운동과 함께 마스터를 파괴하지 않도록합니다.
10. 손해에 대한 실리콘 마스터를 검사합니다.
11. 네 조각으로 부정적인 금형 컷.
12. 부정적인 금형의 대규모 배치에 대한 1-10 단계를 반복합니다.
13. 산소 플라즈마 표면을 활성화 1.5 분 동안 부정적인 금형을 치료하거나,
14. 오존은 표면을 활성화하기 위해 10 분 동안 부정적인 금형을 처리합니다.
15. 노출 mPAD 기능 dessicator에 부정적인 금형을 놓으십시오.
16. dessicator의 중심에 유리 슬라이드에 실란의 250-500 μL을 확산
17. dessicator 안쪽 끝에서 실란의 150-200 μL와 플레이스 유리 파스투레 피펫.
18. 진공 챔버> 14 시간 동안 실란 및 외투 부정적인 금형을 증발합니다.

mPADS

자료 :

• Polydimethylsiloxane (PDMS) 기본 및 치료 에이전트 (다우, 미들랜드, MI)
• 와이드 - 입 일회용 전송 pipettes
• 2 "X 3"유리 슬라이드
• 유리 스크 라이브
• N2

방법 :

1. 거품을 제거하는 1 시간 진공 미만의 무게와 데가스하여 PDMS 10시 1분를 섞습니다.
2. '교차'에 silanized 부정적인 금형을 레이스
3. 피펫 PDMS은 부정적인 금형에 기능이 완전히 1mm 두께로 덮여되도록.
4. 표면에 상승하는 PDMS에 공기 방울 30 분 동안 기다리십시오. </ 리>
5. N2의 흐름 30 '다운 타임에, 먼지 22x22mm (제 2) 유리 coverslips.
6. 산소 플라즈마 처리 유리 슬라이드 유리를 청소하고 활성화 1.5 분 반쪽
7. N2의 빠른 폭발과 PDMS의 표면 갇힌 기포를 날려.
8. 부드럽게 PDMS 직면 플라즈마 청소 면을 PDMS에 유리 coverslip의 가장자리를하다. 천천히 유리 슬라이드를 낮출 수 있도록 PDMS 완전히는 연락처 전체 유리 표면을 것을하고 유리 슬라이드 아래에 갇혀 점점 공기 방울을 피하십시오.
9. 장소는 20 시간 동안 ° C가 완전히 치료 110 대류 오븐에서 금형을 조립.
10. 오븐에서 금형을 제거하고 RT에이 식지.
11. 한 위에 손을 천천히 부정 벗겨 버릴 mPAD 발표 바닥에서 부정적인 금형과 유리 슬라이드를 잡아.
12. 붕괴 게시물에 대한 현미경 mPAD을 검사합니다.
13. 플라즈마와 실란 매 4 주물을 통해 다시 silanize 곰팡이. 좋은 복제에 대한 부정적인 금형 수명은 약 60-20 캐스트입니다.

mPADS에 심는 세포

스탬핑

자료 :

• uCP에 대한 PDMS 스탬프 (조직 공학의 방법에 티엔, J & 첸, CS, 2001 논문집, pp 113-120을 참조하십시오.)
• 에탄올 (100 % 및 70 %)
• 살균 탈이온수
• 무균 탈이온수 50 UG / ML 인간 Fibronectin (BD Biosciences)
• 5 UG / ML DiI 솔루션은 0.2 μm의 막 (D - 3886, 분자 프로브, OR)와 필터링
• 2퍼센트 Pluronics F127 (BASF, 마운트 올리브, NJ)
• 1X 인산 버퍼 솔루션입니다.
• 100mm X 25mm 페트리 접시 (4)
• 150mm X 25mm 페트리 접시 (2)
• 알루미늄 호일
• N2
• 족집게
• 무균 후드

방법 :

1. mPADs에서 트림 초과 PDMS
2. PDMS 스탬프는 이전에 다음 ID로 사용되고있다면, 오염 단백질을 멀리 스크럽 5 분 100 % 에탄올에 우표를 sonicate.
3. 무균 모자, 신선한 100 %의 에탄올과 멸균 물의 우표를 수영 후 핀셋과 N2와 건조 자신의 양쪽에 우표를 개최
4. 측면을 작업과 함께 150mm 배양 접시에 놓습니다.
5. 나누어지는 각 우표에 fibronectin 솔루션 방울. 다음 우표의 각 모서리, 가장자리, 그리고 마지막으로 내부 지역과 함께 시작합니다. 우표의 처음 PDMS의 표면은 소수성이지만, 단백질이 adsorbed와 같이 친수성이된다. 작업 "으로 외부 내부"변경 fibronectin 솔루션의 낮은 볼륨을 완전히 코팅 도장을 필요되도록 PDMS의 접촉 각도.
6. 단백질 흡착을위한 후드 1 시간 동안 앉아 보자.
7. 접시에 쏟아져 및 수위는 우표를 통해 상승시키는 의해 DI 워터와 함께 우표를 씻으십시오.
8. DI 워터 가득 100mm 배양 접시에있는 우표를 씻으십시오.
9. 제거하고 N2와 건조.
10. 오존 처리의 mPADS 7 분 동안 스탬프에 대한 표면을 활성화합니다.
11. 후드에서 mPAD에 스탬프 우위를 넣어 부드럽게 모든 연락처를 만들기 위해 낮추어 mPADS를 도장. 살짝 모든 분야 좋은 접촉을 보장하기 위해 족집게로 우표 상단 탭하지만 게시물을 붕괴하지 않도록주의합니다.
12. 조심스럽게 핀셋와 우표를 제거합니다.
13. ~ 15 초 동안 100 % 에탄올로 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. 요리 사이에 빠르게 전송하여 전송 중에 dewetting에서 microneedles 보관하십시오.
14. ~ 15 초 동안 70 %의 에탄올과 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
15. ~ 15 초 동안 DI 워터와 함께 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
16. ~ 15 초 동안 DI 워터와 두번째 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
17. DI 워터와 함께 150mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
18. DiI 솔루션의 100 ML와 150mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
19. 알루미늄 호일로 뚜껑을 덮고 1 시간 만끽해보세요.
20. ~ 15 초 동안 DI 워터와 함께 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
21. 2 % Pluronics 10 ML 및 0.2 % Pluronics 총 농도에 대한 PBS의 90 ML과 150mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
22. 커버 1 시간 동안 만끽해보세요.
23. ~ 15 초 동안 DI 워터와 함께 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
24. ~ 15 초 동안 DI 워터와 두번째 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.
25. ~ 15 초 동안 PBS하게 제 3 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS.

시딩

자료 :

• 선택한 셀 라인
• 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) • 4Na, Gibco 고양이와 0.25 %의 트립신. 번호 25200-056)
• 성장 매체
• 1X 인산 버퍼 솔루션입니다.

방법 :

1. 무균 후드, 100mm 배양 접시에있는 장소 mPADS 및 17 ML 매체로 기입하십시오.
2. 인큐베이터에 넣어 배양 접시 37을 따뜻하게 ° C
3. 트립신을 통해 세포를 일시 중지
4. 셀 클러스터를 깨고 반복 대기음.
5. mPADS와 페트리 접시에 Pipet 세포 현탁액. 그들이 분석의 시간에 하나의 세포 (세포 세포 접촉없이) 상태로 유지됩니다 이러한 세포를 추가합니다. 추가 세포의 정확한 양은 셀 타입의 특정하고세포 확산 영역과 성장 속도에 따라 다릅니다.
6. 부드럽게 천천히 pippetting와 배양 접시에있는 세포를 해산.
7. 인큐베이터에 넣어 2 시간 동안 세포가 microneedles에 정착하고 준수하도록.
8. 세포가 확산있다면 볼 수 mPADS을 검사합니다. 세포는 평평 보이는 여섯 개 이상의 게시물을 걸쳐 것입니다.
9. 세포가 확산있다면, 신선한 중간 21 ML 새로운 100mm 페트리 접시에 mPADS를 전송할 수 있습니다.
10. mPADS는 실험을위한 준비가되어 있습니다.

mPADS 스테 이닝 및 장착

고정

자료 :

• 탈이온수
• Paraformeldahyde (16 %) 유리병
• 10X 프로스 페이트 버퍼 솔루션입니다.
• 1X 인산 버퍼 솔루션입니다.

방법 :

1. 50mL 원심 분리기 튜브에서 DI 30 ML, paraformeldahyde 10 ML (전체 유리병) 및 고정 솔루션 10X PBS 4.5 ML를 추가합니다.
2. 100mm 페트리 접시에 솔루션을 고칠 수있는 ~ 25 ML을 추가합니다.
3. 부드럽게 잠수함은 접시를 고정으로 전지와 mPAD 20 분 동안 품어하자.
4. 1X PBS로 100mm 그릇에 세 번 잠수함의 mPADS.
5. immunostaining 및 장착을위한 준비.

mPADS에 세포 힘을 분석

공촛점 이미징

자료 :

• 공촛점 현미경
• 63X 목표
• 차 항체에 대한 필터 큐브
• microneedles의 DiI 이미징을위한 그린 필터 큐브 (Rhodamine).

방법 :

1. 플레이스 무대에서 mPADs 및 300 MS 노출, 안돼 비닝 단일 세포를 찾으십시오.
2. TOP 이미지 microneedles의 이미지 꼭대기.
3. Z - 제어 기록을 사용하여, 하단 이미지 microneedles의 이미지를 캡처합니다.
4. 이미지가에 얼룩을 (Hoechst, phalloidin 등)이 다른 채널을

이미지 분석

자료 :

• 이미지 처리 도구와 MATLAB

방법 :

1. 상단과 하단 이미지를 회전하여 등록
2. 측정 하단의 centroids (undeflected)과 최고 (편향) 위치
3. 변위를 계산
4. 게시물 (알려진 게시물 기하학에 따라)에 대한 지속적인 스프링을 사용하여 각 게시물에 힘을 벡터를 계산
5. 오류 분석은 군대를 해결하는 능력에 기반하고 이미지 해상도와 중심 감지 해상도에 따라 달라집니다입니다
6. 다른 조건 등에 걸쳐 예를 들어, 힘 magnitudes 및 / 또는 방향, 시간 과정으로, 많은 측정 - 사용자 정의 필요에 따라 같은 데이터를 정렬