Microfabricated (mPADs) पोस्ट सरणी डिटेक्टरों: एक यांत्रिक बलों पृथक दृष्टिकोण

Summary

इस वीडियो में, हम प्रदर्शन कैसे बनाना और microfabricated पोस्ट सरणी (mPADs) डिटेक्टरों सेलुलर सिकुड़ना के modulations का आकलन करने का उपयोग.

Abstract

इस वीडियो में, हम हमारे दृष्टिकोण पेश करने के लिए सेलुलर कर्षण पदों की एक microfabricated सरणी का उपयोग बलों उपाय करेंगे. ट्रैक्शन बलों मायोसिन-actin बातचीत के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं और हमारे शरीर क्रिया विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. विकास के दौरान, वे कोशिकाओं को एक स्थान से क्रम में करने के लिए अगले स्थानांतरित करने के लिए ऊतक के जल्दी संरचनाओं फार्म में सक्षम. ट्रैक्शन बल चिकित्सा प्रक्रियाओं में मदद करते हैं. वे घाव के समुचित बंद या प्रवास और हमारे शरीर के माध्यम से leukocytes के रेंगने के लिए आवश्यक हैं. ये वही बलों कैंसर मेटास्टेसिस या एक ट्यूमर की ओर संवहनी वृद्धि के मामले में हमारे स्वास्थ्य के लिए हानिकारक हो सकता है. सबसे आम तरीका है जिसके द्वारा इन विट्रो में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक गिलास या polystyrene पकवान का उपयोग करने के लिए किया गया है. हालांकि, substrates की कठोरता यह असंभव शारीरिक रूप से सेल कर्षण बलों को मापने के लिए बनाता है, और वहाँ अपेक्षाकृत कुछ तरीकों कर्षण बलों का अध्ययन कर रहे हैं. हमारी प्रयोगशाला इन सीमाओं को पार करने के लिए तकनीक विकसित की है. विधि लचीला cantilevers, कठोरता और आकार पैमाने जिनमें से ऐसी है कि व्यक्ति की कोशिकाओं के कई cantilevers भर में फैले हैं और उन्हें इस प्रक्रिया में मोड़ना का एक अनुलंब सरणी पर आधारित है. स्तंभों का उपयोग हम व्यास में 3 सुक्ष्ममापी, 10 सुक्ष्ममापी लंबा, और 9 सुक्ष्ममापी रिक्ति केंद्र के लिए केंद्र के साथ एक नियमित सरणी में विन्यस्त कर रहे हैं. लेकिन इन शारीरिक आयाम के अध्ययन की एक किस्म को समायोजित करने के लिए आसानी से किया जा विविध कर सकते हैं. हम एक सिलिकॉन मास्टर के साथ शुरू है, लेकिन अंतिम पोस्ट (डाइमिथाइल siloxane) नामक पाली, या PDMS सिलिकॉन रबर का बना रहे हैं. हम एक खुर्दबीन के नीचे deflections को मापने के लिए और परिमाण और कर्षण मनाया deflections उत्पादन के लिए आवश्यक बलों की दिशा की गणना कर सकते हैं. हम इन substrates के बाद सरणी डिटेक्टरों, या mPADs microfabricated कहते हैं. यहाँ, हम आपको दिखाने के लिए हम कैसे बनाना और mPADs का उपयोग करने के लिए सेलुलर सिकुड़ना के modulations का आकलन करेंगे.

Protocol

सिलिकॉन मास्टर मोल्ड निर्माण

लिथोग्राफी

सामग्री:

• 75 मिमी सिलिकॉन wafers
• SU-8 2 नकारात्मक photoresist (Microchem, बोस्टन, MA)
• N2

विधि:

1. 120 ° सी में 2 घंटे के लिए सी वफ़र निर्जलीकरण.
2. 7 मिनट के लिए यूवी ओजोन का इलाज सतह ऑर्गेनिक्स को दूर करने के लिए.
3. N2 झटका सतह particulates को दूर करने के लिए.
4. लागू SU-8 2 सतह का 70% (~ 75 मिमी वफ़र के लिए 10 मिलीलीटर) को कवर.
5. 20 सेकंड के लिए 2000 rpm पर 300 rpm / s त्वरण के साथ स्पिन.
6. Hotplate और कमरे के तापमान से रैंप पर 95 डिग्री सेल्सियस वफ़र प्लेस
7. 15 मिनट के लिए 95 पर photoresist Softbake डिग्री सेल्सियस
8. बाढ़ बेनकाब 20 के लिए वफ़र - 365 एनएम (लाइन) पर 25 mJ/cm2 खुराक के लिए नीचे की परत के रूप में.
9. लागू SU-8 2 दूसरी photoresist परत के लिए.
10. लगभग एक 11 सुक्ष्ममापी मोटाई फिल्म के लिए 300 rpm / s त्वरण के साथ 20 सेकंड के लिए 550 rpm पर स्पिन.
11. और कमरे के तापमान से एक hotplate और रैंप पर 65 डिग्री सेल्सियस वफ़र प्लेस
12. 65 में वफ़र Softbake डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए.
13. 65 से hotplate रैंप ° 95 सी डिग्री सेल्सियस
14. 55 मिनट के लिए 95 पर वफ़र Softbake डिग्री सेल्सियस
15. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान शांत करने के लिए वफ़र.
16. वफ़र पर mPAD मुखौटा संरेखित करें और 95 के लिए बेनकाब - 365 एनएम पर 100 mJ/cm2 खुराक (लाइन).
17. Hotplate और कमरे के तापमान से रैंप पर 95 डिग्री सेल्सियस वफ़र प्लेस
18. प्रदर्शन के बाद 95 बजे 25 मिनट के लिए photoresist सेंकना डिग्री सेल्सियस

विकसित करना

सामग्री:

• 100mm कांच व्यंजन (5)
• Propylene glycol मिथाइल ईथर एसीटेट (PGMEA)
• Isopropanol (आईपीए)
• N2

विधि:

1. हुड में एक रासायनिक, (2) PGMEA, आईपीए और हेक्सेन (2) के साथ पांच बर्तन भरें.
2. 1 PGMEA में 10 सेकंड के लिए पकड़ो वफ़र
3. 50 सेकंड के लिए वफ़र आंदोलन
4. 2 PGMEA PGMEA का meniscus के साथ वफ़र स्थानांतरण.
5. 5 सेकंड के लिए आंदोलन.
6. आईपीए के लिए PGMEA का meniscus के साथ वफ़र स्थानांतरण.
7. 20 सेकंड के लिए आंदोलन.
8. 1 आईपीए वफ़र स्थानांतरण.
9. 5 सेकंड के लिए आंदोलन.
10. 2 आईपीए वफ़र स्थानांतरण.
11. 5 सेकंड के लिए आंदोलन.
12. जल्दी आइपीए का meniscus के साथ 2 आईपीए से वफ़र और हटाने N2 साथ सूखी
13. पैटर्न निरीक्षण.
14. 120 डिग्री सेल्सियस 14-20 घंटे के लिए पार से लिंक र 8 हादबैक वफ़र.
15. एक हीरे कटर के साथ वफ़र पासा
16. Epoxy का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर वफ़र पर्वत
17. वफ़र Fluorosilanize (प्रतिकृति ढलाई में निर्देश देखें)

MPADS की प्रतिकृति ढलाई

नकारात्मक मोल्ड

सामग्री:

• प्रयोज्य नाव वजन एल्यूमीनियम
• Polydimethylsiloxane (PDMS) आधार और इलाज एजेंट (डॉव, मिडलैंड, एमआई)
• Razorblade
• Silane: (tridecafluoro एक ,1,2,2 tetrahyrooctyl)-1-trichlorosilane
• ग्लास स्लाइड
• ग्लास पाश्चर पिपेट

विधि:

1. वजन और देगास द्वारा PDMS 10:01 1 घंटे बुलबुले हटायें के लिए मिक्स वैक्यूम के अंतर्गत है.
2. एल्यूमीनियम नाव में सिलिकॉन मास्टर मोल्ड प्लेस.
3. डालो 50 - एल्यूमीनियम नाव में मास्टर मोल्ड के 60 से अधिक PDMS के छ.
4. 30 मिनट बुलबुले को दूर करने के लिए वैक्यूम के अंतर्गत देगास.
5. N2 के त्वरित विस्फोट के साथ बंद सतह फंस हवाई बुलबुले उड़ा PDMS में.
6. प्लेस नाव संवहन ओवन में 110 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए जब तक PDMS फर्म है.
7. दूर कट एल्यूमीनियम नाव.
8. Razorblade के साथ, दूर सिलिकॉन मास्टर नीचे PDMS ट्रिम.
9. पील PDMS सिलिकॉन मास्टर से दूर धीरे धीरे और एक ही दिशा में निरंतर गति के साथ मास्टर को नष्ट करने से बचने के लिए.
10. क्षति के लिए सिलिकॉन मास्टर का निरीक्षण किया.
11. 4 टुकड़ों में नकारात्मक मोल्ड कट.
12. नकारात्मक molds के एक बड़े बैच के लिए 1-10 कदम दोहराएँ.
13. 1.5 से सतह सक्रिय मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा नकारात्मक मोल्ड का इलाज है, या
14. ओजोन 10 मिनट करने के लिए सतह को सक्रिय के लिए नकारात्मक मोल्ड इलाज.
15. MPAD उजागर सुविधाओं के साथ dessicator में नकारात्मक molds रखें.
16. Dessicator के केंद्र में गिलास स्लाइड पर silane के 250-500 μL बिखरा हुआ
17. Dessicator अंदर टिप में silane 150-200 μL के साथ प्लेस कांच चरागाह विंदुक.
18. निर्वात चैम्बर> 14 घंटे के लिए silane और कोट नकारात्मक molds के लुप्त हो जाना करने के लिए.

mPADS

सामग्री:

• Polydimethylsiloxane (PDMS) आधार और इलाज एजेंट (डॉव, मिडलैंड, एमआई)
• चौड़े मुँह डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipettes
• 2 "x 3" ग्लास स्लाइड्स
• ग्लास मुंशी
• N2

विधि:

1. वजन और देगास द्वारा PDMS 10:01 1 घंटे बुलबुले हटायें के लिए मिक्स वैक्यूम के अंतर्गत है.
2. 'पार' में silanized नकारात्मक molds के फीता
3. पिपेट PDMS ताकि नकारात्मक molds में सुविधाओं पूरी तरह से एक 1mm मोटाई कवर कर रहे हैं.
4. PDMS में किसी भी हवाई बुलबुले के लिए 30 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए सतह को जन्म </ Li>
5. 30 'स्र्कना, धूल 22x22mm (सं 2) N2 की एक धारा के साथ कांच coverslips.
6. ऑक्सीजन प्लाज्मा का इलाज गिलास स्लाइड 1.5 मिनट के लिए आधा गिलास स्वच्छ और सक्रिय
7. N2 के त्वरित विस्फोट के साथ बंद सतह फंस हवाई बुलबुले उड़ा PDMS में.
8. धीरे PDMS पर प्लाज्मा साफ PDMS का सामना करना पड़ पक्ष के साथ कांच coverslip के किनारे रखे. धीरे - धीरे कम गिलास स्लाइड PDMS पूरी तरह से पूरे गिलास सतह संपर्क है कि इतनी और हवा गिलास स्लाइड के नीचे फंस हो रही बुलबुले से बचने के.
9. प्लेस 110 संवहन ओवन में molds इकट्ठे ° 20 घंटे के लिए सी पूरी तरह से इलाज करने के लिए.
10. ओवन से molds निकालें और उन्हें आरटी शांत करने के लिए चलो.
11. शीर्ष पर एक हाथ और धीरे धीरे नकारात्मक छील दूर नीचे से नकारात्मक मोल्ड mPAD रिलीज के साथ गिलास स्लाइड पकड़ो.
12. MPAD ढह पदों के लिए एक खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण किया.
13. प्लाज्मा और silane हर चार कास्टिंग के माध्यम से मोल्ड पुनः silanize. अच्छा प्रतिकृति के लिए नकारात्मक मोल्ड जीवनकाल लगभग 6-20 डाले है.

MPADS पर सीडिंग कक्ष

मुद्रांकन

सामग्री:

• UCP के लिए PDMS टिकटों (टीएन, जम्मू एवं चेन, सीएस, ऊतक इंजीनियरिंग के तरीके में, 2001, पीपी 113-120 देखें.)
• इथेनॉल (100% और 70%)
• निष्फल विआयनीकृत जल
• 50 स्नातकीय / बाँझ विआयनीकृत पानी में मिलीलीटर मानव fibronectin (बी.डी. बायोसाइंसेज)
• 5 / स्नातकीय मिलीलीटर DiI समाधान 0.2 सुक्ष्ममापी झिल्ली (D-3886, आण्विक जांच, या) के साथ फ़िल्टर
• 2% Pluronics F127 (BASF, माउंट ओलिव, न्यू जर्सी)
• 1X फास्फेट बफर समाधान.
• 100 मिमी x 25 मिमी पेट्री डिश (4)
• 150 मिमी x 25 मिमी पेट्री डिश (2)
• एल्यूमीनियम पन्नी
• N2
• चिमटी
• बाँझ हूड

विधि:

1. MPADs से छाँटो अतिरिक्त PDMS
2. यदि PDMS स्टांप पहले प्रयोग किया गया है, 100% इथेनॉल में 5 मिनट दूर contaminating प्रोटीन हाथ धोने के लिए टिकटों sonicate.
3. बाँझ हुड में, चिमटी और N2 के साथ सूखा के साथ ताजा 100% इथेनॉल और बाँझ पानी में टिकटों की सूई के बाद अपने पक्ष पर टिकटों की पकड़
4. ओर काम कर के साथ 150 मिमी पेट्री डिश में रखें.
5. विभाज्य fibronectin समाधान के प्रत्येक टिकट पर चला जाता है. टिकटों की प्रत्येक पर कोनों, तो किनारों, और अंत में आंतरिक क्षेत्रों के साथ शुरू करो. शुरू में टिकट के PDMS सतह hydrophobic है, लेकिन हाइड्रोफिलिक हो जाता है के रूप में प्रोटीन adsorbed है. कार्य "बाहर अंदर" परिवर्तन PDMS के संपर्क कोण ताकि fibronectin समाधान के एक कम मात्रा पर पूरी तरह से स्टांप कोट की जरूरत है.
6. चलो प्रोटीन सोखना के लिए हुड में 1 घंटे के लिए बैठते हैं.
7. डिश में डालने के लिये और दे जल स्तर टिकटों में वृद्धि के द्वारा डि पानी के साथ टिकटों धो लें.
8. 100 मिमी पेट्री डि पानी से भरा पकवान में टिकटों को धो लें.
9. निकालें और N2 के साथ शुष्क.
10. ओजोन का इलाज mPADS मुद्रांकन के लिए 7 मिनट के लिए सतह को सक्रिय करने के लिए.
11. हुड के तहत, mPAD पर स्टांप किनारे रखने और धीरे से पूर्ण संपर्क बनाने के लिए कम से mPADS स्टाम्प. हल्के चिमटी के साथ टिकट के शीर्ष का दोहन करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी क्षेत्रों में अच्छे संपर्क है लेकिन प्रविष्टियाँ पतन नहीं सावधान रहना.
12. ध्यान से चिमटी के साथ टिकटों को हटा दें.
13. 100 ~ 15 सेकंड के लिए 100% इथेनॉल के साथ मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS. स्थानांतरण के दौरान व्यंजन के बीच जल्दी से स्थानांतरित द्वारा dewetting से microneedles रखें.
14. ~ 15 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
15. डि ~ 15 सेकंड के लिए पानी के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
16. दूसरा 100 मिमी ~ 15 सेकंड के लिए डि पानी के साथ पेट्री डिश में डूब mPADS.
17. डि पानी के साथ 150 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
18. DiI समाधान के 100 एमएल के साथ 150 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
19. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और 1 घंटे के लिए सोख.
20. डि ~ 15 सेकंड के लिए पानी के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
21. में 2% Pluronics के 10 एमएल और 0.2% Pluronics की कुल एकाग्रता के लिए 90 एमएल पीबीएस के साथ 150 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
22. कवर और 1 घंटे के लिए सोख.
23. डि ~ 15 सेकंड के लिए पानी के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में डूब mPADS.
24. दूसरा 100 मिमी ~ 15 सेकंड के लिए डि पानी के साथ पेट्री डिश में डूब mPADS.
25. तीसरे ~ 15 सेकंड के लिए 100 मिमी पीबीएस के साथ पेट्री डिश में डूब mPADS.

बीज बोने की क्रिया

सामग्री:

• चुना सेल लाइन
• Trypsin EDTA (0.25% trypsin EDTA • 4Na, Gibco बिल्ली के साथ 25200-056 सं.)
• विकास मध्यम
• 1X फास्फेट बफर समाधान.

विधि:

1. बाँझ डाकू, 100 मिमी पेट्री डिश में जगह mPADS और 17 एमएल माध्यम के साथ भरें.
2. इनक्यूबेटर में प्लेस पेट्री डिश 37 तक गर्म करने के लिए डिग्री सेल्सियस
3. Trypsin के माध्यम से कोशिकाओं को निलंबित
4. बार - बार Aspirate सेल समूहों को तोड़ने.
5. Pipet mPADS साथ पेट्री डिश में सेल निलंबन. जैसे वे विश्लेषण के समय में एकल कोशिकाओं (सेल सेल संपर्क के बिना) रहेगा कोशिकाओं जोड़ें. कोशिकाओं के सटीक राशि जोड़ने के सेल प्रकार के विशिष्ट है औरसेल प्रसार क्षेत्र और विकास दर पर निर्भर करता है है.
6. धीरे धीमी pippetting साथ पेट्री डिश में कोशिकाओं को फैलाने.
7. इनक्यूबेटर में प्लेस 2 घंटे के लिए कोशिकाओं बसने और microneedles पर पालन करने की अनुमति.
8. MPADS निरीक्षण देखने के लिए अगर कोशिकाओं फैला है. कोशिकाओं चपटे देखो और छह या अधिक पदों अवधि.
9. यदि कोशिकाओं में फैले हुए हैं, ताजा माध्यम के 21 एमएल के साथ नए 100 मिमी पेट्री डिश के लिए mPADS हस्तांतरण.
10. mPADS अपने प्रयोग के लिए तैयार हैं.

धुंधला और बढ़ते mPADS

फिक्सिंग

सामग्री:

• विआयनीकृत जल
• Paraformeldahyde शीशी (16%)
• 10X फास्फेट बफर समाधान.
• 1X फास्फेट बफर समाधान.

विधि:

1. एक 50ml अपकेंद्रित्र ट्यूब, के 30 एमएल डि, paraformeldahyde के 10 एमएल (पूरे शीशी), और फिक्सिंग के समाधान के लिए 4.5 एमएल 10X पीबीएस जोड़ें.
2. ~ 100 मिमी पेट्री डिश समाधान फिक्सिंग के 25 एमएल जोड़ें.
3. धीरे डूब पकवान फिक्सिंग में कोशिकाओं के साथ mPAD सेते हैं और 20 मिनट के लिए चलो.
4. 1X पीबीएस के साथ 100 मिमी पकवान तीन बार में डूब mPADS.
5. Immunostaining और बढ़ते के लिए तैयार है.

MPADS पर सेलुलर बलों विश्लेषण

Confocal इमेजिंग

सामग्री:

• Confocal खुर्दबीन
• 63X उद्देश्य
• माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए फ़िल्टर क्यूब्स
• DiI microneedles की इमेजिंग के लिए ग्रीन फिल्टर क्यूब (rhodamine).

विधि:

1. मंच पर प्लेस mPADs और 300 एमएस प्रदर्शन, कोई binning के साथ एकल कक्षों लगता है.
2. शीर्ष छवि के लिए microneedles की छवि सबसे ऊपर है.
3. Z नियंत्रण readout का प्रयोग, नीचे की छवि के लिए microneedles की छवि पर कब्जा.
4. आप में दाग (Hoechst, phalloidin आदि) है किसी अन्य चैनल के छवि

छवि विश्लेषण

सामग्री:

• MATLAB के साथ छवि प्रसंस्करण साधन

विधि:

1. घुमाएँ और ऊपर और नीचे छवियाँ रजिस्टर
2. नीचे के उपाय centroids (undeflected) और शीर्ष पदों (विक्षेपित)
3. विस्थापन परिकलित
4. प्रविष्टियाँ (जाना जाता है, पोस्ट ज्यामिति पर निर्भर करता है) के लिए निरंतर वसंत का प्रयोग, प्रत्येक पोस्ट पर बल सदिश की गणना
5. त्रुटि विश्लेषण करने के लिए सेना को हल करने की क्षमता पर आधारित है, और छवि संकल्प और केन्द्रक पता लगाने के संकल्प पर निर्भर करता है
6. जैसे, बल magnitudes और / या दिशा, एक समय के पाठ्यक्रम के रूप में, कई माप - आपके अनुकूलित जरूरतों के प्रति के रूप में डेटा व्यवस्थित विभिन्न स्थितियों आदि के पार