Microfabriqués post-Array-détecteurs (mPADs): une approche pour isoler les forces mécaniques

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons comment fabriquer et utiliser des détecteurs matriciels microfabriqué poste (mPADs) pour évaluer les modulations de la contractilité cellulaire.

Abstract

Dans cette vidéo, nous allons présenter notre approche pour mesurer les forces de traction cellulaire en utilisant un large microfabriqué de postes. Les forces de traction sont générées par la myosine-actine interactions et jouer un rôle important dans notre physiologie. Au cours du développement, ils permettent aux cellules de se déplacer d'un endroit à l'autre afin de former les structures début des tissus. Les forces de traction aider dans le processus de guérison. Ils sont nécessaires à la bonne fermeture de plaies ou de la migration des leucocytes et de ramper à travers notre corps. Ces mêmes forces peuvent être nuisibles à notre santé en cas de métastases du cancer ou de croissance vasculaire vers une tumeur. La méthode la plus commune par laquelle l'étude des cellules in vitro a été d'utiliser un verre ou un plat en polystyrène. Cependant, la rigidité des substrats rend impossible de mesurer physiquement les forces de traction cellulaire, et il existe des méthodes relativement peu d'étudier les forces de traction. Notre laboratoire a développé une technique pour surmonter ces limitations. La méthode est basée sur un réseau vertical de cantilevers flexible, la rigidité et la taille de l'échelle qui sont telles que les cellules individuelles réparties sur de nombreuses consoles les détourner dans le processus. Les piliers que nous utilisons sont de 3 m de diamètre, 10 um de haut, et sont configurés dans un réseau régulier avec 9 um centre à centre de l'espacement. Mais ces dimensions physiques peuvent être facilement variées pour accueillir une variété d'études. Nous commençons avec un maître de silicium, mais les messages finales sont faites de caoutchouc de silicone appelée poly (diméthyl siloxane), ou PDMS. Nous pouvons mesurer les déformations sous un microscope et de calculer la magnitude et la direction des forces de traction requise pour produire des déviations observées. Nous appelons ces substrats microfabriqué après-array-détecteurs ou mPADs. Ici, nous allons vous montrer comment nous fabriquons et utiliser le mPADs d'évaluer les modulations de la contractilité cellulaire.

Protocol

Fabrication Moule en silicone

Lithographie

Matériaux:

• 75 tranches de silicium mm
• SU-8 2 photoresist négatif (Microchem, Boston, MA)
• N2

Méthode:

1. Déshydrater wafer silicium à 120 ° C pendant 2 heures.
2. UV traitement de surface d'ozone pendant 7 minutes pour enlever des matières organiques.
3. De surface soufflent N2 pour éliminer les particules.
4. Appliquer SU-8 2 pour couvrir 70% de la surface (~ 10 ml pour 75 plaquette mm).
5. Centrifuger à 2000 rpm pendant 20 secondes avec une accélération 300 tr / s.
6. Placer la galette sur une plaque chauffante et la rampe de la température ambiante à 95 ° C.
7. Softbake la résine pendant 15 minutes à 95 ° C.
8. Flood exposent plaquette pour 20 - 25 mJ/cm2 dose à 365 nm (I-line) pour former la couche inférieure.
9. Appliquer SU-8 2 pour la couche photosensible secondes.
10. Spin à 550 rpm pendant 20 secondes avec une accélération 300 tr / s pour un film d'environ 11 um d'épaisseur.
11. Placer la galette sur une plaque chauffante et la rampe de la température ambiante à 65 ° C.
12. Softbake la plaquette à 65 ° C pendant 5 minutes.
13. Rampe de la plaque de cuisson de 65 ° C à 95 ° C.
14. Softbake la galette pendant 55 minutes à 95 ° C.
15. Plaquette refroidir à température ambiante pendant 20 minutes.
16. Aligner le masque sur la plaquette et mPAD exposer pour 95 à 100 mJ/cm2 dose à 365 nm (I-line).
17. Placer la galette sur une plaque chauffante et la rampe de la température ambiante à 95 ° C.
18. Post-exposition cuire la résine pendant 25 minutes à 95 ° C.

Développer

Matériaux:

• Plats en verre 100mm (5)
• Le propylène glycol méthyl éther acétate (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Méthode:

1. Dans une hotte chimique, combler cinq plats avec PGMEA (2), IPA, et l'hexane (2).
2. Tenez plaquette en 1ère PGMEA pendant 10 secondes
3. Agiter plaquette pendant 50 secondes
4. Transfert à la 2e tranche de PGMEA avec ménisque du PGMEA.
5. Agiter pendant 5 secondes.
6. Transfert plaquette d'IPA avec ménisque du PGMEA.
7. Agiter pendant 20 secondes.
8. Transfert plaquette au 1er IAP.
9. Agiter pendant 5 secondes.
10. Transfert à l'IPA plaquette 2e.
11. Agiter pendant 5 secondes.
12. Enlever rapidement les plaquettes de l'IPA 2ème avec ménisque de l'IPA et sec avec N2
13. Inspectez motif.
14. Plaquette Hardbake à 120 ° C pendant 14-20 heures pour réticuler SU-8.
15. Dés la plaquette avec un tailleur de diamants
16. Montez la plaquette sur une lame de verre à l'aide d'époxy
17. Fluorosilanize la plaquette (voir les instructions dans le moulage de réplication)

Le moulage de la réplication du mPADS

Moule négatif

Matériaux:

• Aluminium jetables pesant bateau
• Agent de polydiméthylsiloxane (PDMS) de base et de durcissement (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Silane: (tridécafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-trichlorosilane
• Lame de verre
• Pipette Pasteur en verre

Méthode:

1. Mélanger PDMS 10:01 en poids et dégazer en sous vide pendant 1 heure pour éliminer les bulles.
2. Placez moule maître de silicium dans un bateau en aluminium.
3. Verser 50 - 60 g de PDMS sur moule maître de bateau en aluminium.
4. Degas sous vide pendant 30 minutes pour enlever les bulles.
5. Soufflez des bulles d'air piégées dans la surface-PDMS souffle rapide de N2.
6. Bateau Mettre au four à convection à 110 ° C pendant 15 minutes jusqu'à ce que le PDMS est ferme.
7. Coupez bateau en aluminium.
8. Avec lame de rasoir, rogner PDMS dessous de silicium maître.
9. Peler PDMS loin de maîtrise de silicium lentement et avec le mouvement constant dans une direction pour éviter de détruire le maître.
10. Inspectez maître de silicium pour les dommages.
11. Couper moule négatif en 4 morceaux.
12. Répétez les étapes 1-10 pour un grand lot de moules négatifs.
13. Plasma d'oxygène traiter moule négatif de 1,5 minutes pour activer la surface, ou
14. Ozone traiter moule négatif pendant 10 minutes pour activer la surface.
15. Placer les moules dans la négative dessicateur avec des fonctionnalités mPAD exposés.
16. Fais 250-500 ul de silane sur lame de verre dans le centre de dessiccateur
17. Placez la pipette en verre avec des pâturages 150-200 uL de silane dans le bout intérieur de dessiccateur.
18. Chambre à vide à s'évaporer silane et du pelage des moules négatifs pour les> 14 heures.

mPADS

Matériaux:

• Agent de polydiméthylsiloxane (PDMS) de base et de durcissement (Dow, Midland, MI)
• Col large pipettes de transfert jetables
• 2 "x 3" lames de verre
• Scribe verre
• N2

Méthode:

1. Mélanger PDMS 10:01 en poids et dégazer en sous vide pendant 1 heure pour éliminer les bulles.
2. dentelles silanisé moules négatifs en «croix»
3. Pipeter PDMS dans des moules négatifs de sorte que les fonctionnalités sont entièrement couverts d'une épaisseur de 1 mm.
4. Attendre 30 minutes pour les bulles d'air dans le PDMS à monter à la surface. </ Li>
5. En 30 'indisponibilité, de la poussière de verre 22x22mm lamelles (n ° 2) avec un courant de N2.
6. Oxygène diapositives plasma traitent le verre moitiés de 1,5 minutes pour nettoyer et activer le verre
7. Soufflez des bulles d'air piégées dans la surface-PDMS souffle rapide de N2.
8. Posez délicatement du bord du verre sur la lamelle PDMS avec le côté du plasma nettoyé en face du PDMS. Abaissez lentement la lame de verre pour que le PDMS totalement contact avec la surface du verre et d'éviter les bulles d'air se trouver piégé sous le lame de verre.
9. Placer les moules dans les assemblées four à convection à 110 ° C pendant 20 heures pour sécher complètement.
10. Retirer les moules du four et laisser refroidir à température ambiante.
11. Tenez lame de verre avec une main sur le dessus et retirez lentement l'écart négatif le moule négatif à partir du bas pour libérer le mPAD.
12. Inspectez le mPAD sous un microscope pour des postes effondrés.
13. Re-silaniser moule via le plasma et le silane tous les quatre pièces coulées. La durée de vie moule négatif pour la réplication est d'environ 60 à 20 bonnes moulages.

Cellules ensemencement sur mPADS

Estampillage

Matériaux:

• PDMS des timbres pour UCP (voir Tien, J & Chen, CS, dans les méthodes de l'ingénierie tissulaire, 2001, p. 113-120.)
• L'éthanol (100% et 70%)
• Eau stérilisée désionisée
• 50 pg / ml de fibronectine humaine dans l'eau déminéralisée stérile (BD Biosciences)
• 5 ug / ml, solution DiI filtrée avec membrane de 0,2 um (D-3886, Molecular Probes, OU)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey)
• Solution 1X tampon phosphate.
• 100 mm x 25 mm boîte de Petri (4)
• 150 mm x 25 mm boîte de Petri (2)
• Le papier d'aluminium
• N2
• Pince à épiler
• Hotte stérile

Méthode:

1. Garniture excès de PDMS à partir mPADs
2. Si le timbre en PDMS a été utilisé précédemment, soniquer timbres dans de l'éthanol à 100% pendant 5 minutes pour frotter loin protéines contaminantes.
3. Dans hotte stérile, maintenez timbres sur leurs côtés avec des pincettes et sec avec N2 après trempage dans de l'éthanol timbres 100% frais et l'eau stérile
4. Placer dans 150 mm boîte de Petri avec le travail vers le haut.
5. Aliquoter gouttes de solution de fibronectine sur chaque timbre. Commencez par les coins sur chacun des timbres, puis les bords, et enfin les régions de l'intérieur. Initialement la surface du timbre en PDMS est hydrophobe, mais devient hydrophile que la protéine est adsorbée. Travail "extérieur vers l'intérieur" change l'angle de contact du PDMS afin qu'un faible volume de solution de fibronectine est nécessaire pour bien enrober les timbres.
6. Laisser reposer pendant 1 heure dans le capot pour l'adsorption des protéines.
7. Laver à l'eau DI timbres en versant dans le plat et laisser le niveau d'eau augmenter au cours des timbres.
8. Lavez timbres dans 100 mm boîte de Petri remplie d'eau DI.
9. Retirez et sécher avec N2.
10. MPADS traiter l'ozone pendant 7 minutes pour activer la surface d'estampage.
11. Sous le capot, le cachet mPADS en plaçant bord de timbre sur les mPAD et doucement pour faire baisser le plein contact. Frapper légèrement le haut du timbre avec des pincettes pour s'assurer que toutes les régions ont un bon contact, mais attention à ne pas l'effondrement des postes.
12. Retirez délicatement timbres avec des pincettes.
13. MPADS Submergez dans 100 boîtes de Pétri mm avec 100% d'éthanol pour ~ 15 secondes. Gardez micro-aiguilles de démouillage lors du transfert par le transfert rapide entre les plats.
14. MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri à l'éthanol 70% pour les ~ 15 secondes.
15. MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri avec de l'eau DI pour ~ 15 secondes.
16. MPADS Submergez dans le deuxième boîte de Pétri de 100 mm avec de l'eau DI pour ~ 15 secondes.
17. MPADS Submergez dans 150 boîtes de Pétri mm avec de l'eau DI.
18. MPADS Submergez dans 150 boîtes de Pétri mm avec 100 ml de solution de DII.
19. Couvrir de papier aluminium et laisser tremper pendant 1 heure.
20. MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri avec de l'eau DI pour ~ 15 secondes.
21. MPADS Submergez dans 150 boîtes de Pétri mm avec 10 ml de Pluronics 2% et 90 ml de PBS pour la concentration totale de Pluronics 0,2%.
22. Couvrir et laisser tremper pendant 1 heure.
23. MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri avec de l'eau DI pour ~ 15 secondes.
24. MPADS Submergez dans le deuxième boîte de Pétri de 100 mm avec de l'eau DI pour ~ 15 secondes.
25. MPADS Submergez en troisième boîte de Pétri de 100 mm avec du PBS pour ~ 15 secondes.

Semis

Matériaux:

• Lignée cellulaire choisie
• Trypsine-EDTA (0,25% de trypsine avec EDTA • 4NA, Cat Gibco. N ° 25200-056)
• Milieu de croissance
• Solution 1X tampon phosphate.

Méthode:

1. Dans hotte stérile, mPADS lieu en 100 mm boîte de Petri et de remplir avec 17 ml de milieu.
2. Placez boîte de Petri dans un incubateur à réchauffer à 37 ° C
3. Suspendre les cellules par la trypsine
4. Aspirer à plusieurs reprises pour briser des amas de cellules.
5. Suspension de cellules de pipette dans la boîte de Pétri avec le mPADS. Ajouter ces cellules, ils resteront des cellules individuelles (sans contacts cellule-cellule) au moment de l'analyse. Le montant exact de cellules à ajouter est un type de cellule spécifique etdépend de zone de propagation des cellules et le taux de croissance.
6. Doucement se dispersent dans les cellules boîte de Pétri avec pippetting lente.
7. Placer dans un incubateur pendant 2 heures pour permettre aux cellules de s'établir et de se conformer sur micro-aiguilles.
8. Inspectez mPADS pour voir si les cellules se sont propagées. Les cellules se penchera aplati et durée de six ou plus de postes.
9. Si les cellules sont réparties, le transfert à de nouveaux mPADS boîte de 100 mm de Pétri avec 21 ml de milieu frais.
10. Le mPADS sont prêtes pour votre expérience.

Coloration et montage mPADS

Fixation

Matériaux:

• L'eau déminéralisée
• Paraformeldahyde (16%) flacon
• 10X solution tampon phosphate.
• Solution 1X tampon phosphate.

Méthode:

1. Dans un tube de 50 ml à centrifuger, ajouter 30 ml de di, 10 ml de paraformeldahyde (flacon entier), et 4,5 mL de PBS 10X pour la solution de fixation.
2. Ajouter ~ 25 mL de solution à la fixation d'un plat de Pétri de 100 mm.
3. Doucement submerger mPAD avec des cellules dans la fixation de plat et laisser incuber pendant 20 minutes.
4. MPADS Submergez dans 100 mm avec plat du PBS 1X à trois reprises.
5. Prêt pour immunocoloration et de montage.

Analyse des Forces cellulaire sur mPADS

Imagerie confocale

Matériaux:

• Microscope confocal
• Objectif 63X
• Cubes de filtre pour les anticorps secondaires
• Filtre vert cube (rhodamine) pour DiI imagerie de micro-aiguilles.

Méthode:

1. MPADs place sur scène et de trouver des cellules individuelles d'exposition avec 300 ms, pas de binning.
2. Sommets Image de micro-aiguilles d'image supérieure.
3. En utilisant z-contrôle de lecture, capture d'images de micro-aiguilles d'image du bas.
4. Image d'autres canaux que vous avez des taches dans (Hoechst, phalloïdine etc)

Image Analysis

Matériaux:

• MATLAB avec Image Processing Toolbox

Méthode:

1. Rotation et d'enregistrer des images en haut et en bas
2. Centroïdes Mesure de bas (déviés) et supérieure (dévié) postes
3. Calculer le déplacement
4. Utilisation de la constante de ressort pour les postes (connue, dépend de la géométrie de poste), calculer vecteur de force à chaque poste
5. Analyse d'erreur est basé sur la capacité de résoudre des forces, et dépend de la résolution de l'image et la résolution de détection centroïde
6. Organiser les données selon vos besoins personnalisés - par exemple grandeurs vigueur, et / ou la direction, comme un cours du temps, de nombreuses mesures dans des conditions différentes, etc