Summary
Автоматизированный метод миография для измерения силы в изолированных артерий брыжеечной описано. В нем занято Mulvany-Гальперн Авто Двойной Myograph провода 510A для определения ответов на фенилэфрин и внеклеточного кальция. Метод позволяет последовательно определения изометрической ответы на агонисты в мелких сосудах диаметром 60 - 300 мкм, независимо друг от друга.
Protocol
1. Выделение крысы брыжеечной артерии небольшого
- Обезболить животное с изофлуран в закрытую камеру и протрите живот спиртом.
- Выполните средней линии лапаротомии выявить брыжеечной постели.
- Использование ножницы, удалить около 85 см кишечника с кормлением сосудистую с верхней брыжеечной артерии. Вырезать проксимальный конец кишечной разделе близко к привратника и дистального конца ближайшем подвздошно-coecal перехода. Сегменты кишечника изолированы от крыс, которые являются глубоко под наркозом с изофлуран и эвтаназии путем открытой грудью пункции сердца.
- Размещенные вырезали раздел покрытием чашке Петри содержащие PSS и выполнять рассечение брыжеечной артерии при комнатной температуре.
- Придавить проксимальный конец кишки на правой стороне и пин-код из оставшейся части intestineina против часовой стрелки (ieproximal конце слева сосудистой питаются той стороне кишки).
- Рассеките из филиала II и III сегментов вместе с куском проксимальном сегменте.
- Рассеките из вены и артерии изоляции (с V-форму точки ветвления) и очистить его, удалив жировой и соединительной ткани. Избегайте прямого контакта с артерией, потянув осторожно пинцетом и резка через мембрану соединительной ткани.
2. Монтаж судно
- Вырежьте два коротких сегментов (≈ 4 см) 40 мкм вольфрама без проволоки из нержавеющей стали и с тонкой щипцы, вставить один в просвет артерии каждого заботиться, чтобы не повредить эндотелий. Используйте провод наконечник, чтобы открыть просвет, если необходимо. Кровь потокового из сосуда является хорошим знаком просвет открыт.
- Заполните myograph камеру с физиологическим раствором поваренной соли (PSS, мм: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO 4 .7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl 2, 20 HEPES и 5 глюкозы, рН 7,4) с аскорбиновой кислотой (100 мкМ) при 37 ° C и с помощью щипцов тщательно передачи резьбовой сегмент судна из чашки Петри в камере при комнатной температуре и передачи вырезали проксимальный сегмент судна myograph камере и тянуть конца вдоль провода, чтобы кормить его в сосуд. Избегайте растяжения сосудов.
- Безопасные ближнем конце провода против часовой стрелки при ближайшем винт крепления на правой челюсти связаны с микрометра. Поймать свободный конец проволоки пинцетом и закрепите его по часовой стрелке при далеко винт крепления на правой челюсти. Убедитесь, что судно сегменте вдоль провода находится в промежутке между челюстями без каких-либо контактов с челюстью себя.
- Винт челюстей друг от друга, и выровняйте второй параллельной проволоки с судна и вставить его в дальнем конце просвета. Аккуратно кормить провод через просвет сосуда в одном сегменте движения с помощью уже смонтирован провод в качестве ориентира. Держите провод около 1 см от судна, чтобы избежать растяжения во время маневра, не дотрагиваясь до эндотелия.
- Винт челюсти вместе и убедиться, что второй монтажный провод перемещается под первый залог правой челюсти.
- Безопасные ближнем конце второй провод в направлении по часовой стрелке при ближайшем винт крепления левой челюсти подключен к преобразователю.
- Безопасные дальнем конце провода под крепежный винт с левой стороны челюсти и затянуть, чтобы протянуть провода.
- После завершения монтажа, сброс двигателя в "Монтаж Меню" и начать нормализацию судна.
3. Нормализация
Авто Двойной Myograph проводная система-510A имеет автоматизированную функцию нормализации, который оценивается от "нормализации" в меню и позволяет судну быть растянут на нормированные внутренней окружности, стандартизированные процедуры в соответствии с протоколом производителя после уравновешивания в течение 30 мин при 37 ° C. Экспоненциальная кривая затем установлены на внутренние данные давления окружности. Процедура определяет диаметр просвета (D 100), что артерии имело бы в естественных условиях, когда расслабился и под трансмуральный давление 100 мм рт.ст. 1 нормализации параметров крысы брыжеечной артерии состоят в следующем.:
- Целевая трансмуральный давление = 13,3 кПа (100 мм рт.ст.).
- Время = 60 сек, продолжительность каждого из нормализации шаги.
- IC 1 / IC 100 = 0,9 (IC 1 = нормированного внутренней окружности, IC 100 = внутренняя окружности соответствующего целевого давления.
- Окуляр калибровки 2 * Δ (мм / глазных деление), 2 дельта для программирования причинам.
Измерьте длину установлен брыжеечной артерии использованием микроскопа окуляра чтениях, когда волоски более ближнего и дальнего концов установлен сосуд SEGMENT. Короче говоря, длина судна установлен сегмент измеряется при максимальном увеличении, используя калиброванный глазного окуляра в микроскопе рассечение. Окуляр чтение с волосами линию над дальнем конце сегмента (1) и ближнем конце сегмента (2) в глазной подразделения измеряется и регистрируется. Эти ценности, с показаниями микрометра, до и после растяжения сосудов документально оформлены и введены в меню для программы для расчета установлены кривой и внутренний диаметр соответствующей целевой трансмуральный давление 100 мм рт.ст.
В наших исследованиях артерий были настроены на просвет диаметром D 1 = 0,9 XD 100, где активное развитие сила максимальна. Активное развитие силы ≥ 10 мН в артериях крыс брыжеечной считается оптимальной для экспериментов, чтобы продолжить. Ткани с более активной силой были отброшены.
4. Измерение ответы
После нормализации, механические и функциональные свойства сосудов вновь активирована, выполняя «стандартный старт", которая включает в себя сложные суда повторного применения (обычно 2 или 3) 5 мкМ фенилэфрин (ПЭ) для получения воспроизводимых сокращений. Типичный "стандартный старт" в нашей лаборатории состоит из серии стимуляций и вымывания периоды следующим образом:
- Замените myograph камеру крышкой и начать аэрации с 95% воздуха и 5% СО 2.
- Заполнить камеру со свежими PSS (содержащий 100 мкМ аскорбиновой кислоты)
- Договор судно с 5 мкМ PE в течение 5 мин и мыть 4 раза PSS буфера.
- После последней стирки, заправка камера с PSS и подождать 3 минуты, прежде чем повторять шаги (II) и (III).
После стандартного начала артерии готов к эксперименту. Релаксаций контракту судов оцениваются путем кумулятивного добавления возрастающих концентрациях CaCl 2 (0,5 - 4 мм). Когда ингибиторов используются суда предварительно инкубировали с соединениями в myograph камере в течение 20 мин и присутствовать во время анализов.
5. Анализ данных
"Нормализация" данные для судов и силы обводка, непосредственно преобразуется в текстовые данные были проанализированы с SigmaPlot 11,0 графические программы (Systat Software, Поинт Ричмонд, штат Калифорния) и на графике как показано на рисунке 1. Концентрация данных о реакции, рассчитанная по обводка, были проанализированы определения ЭК 50 значений от экспериментальных данных установлены на четырех параметров логистической функции в фармакологии меню программы. Сравнения между группами и внутри групп были проведены One Way дисперсионного анализа (ANOVA) и различия при р <0,05, считаются существенными.
6. Представитель Результаты:
| Параметры | Вистар | Даль Соль-Sensitive | Даль солеустойчивые |
|---|---|---|---|
| L 100 (мкм) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117,45 ± 8,43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| R 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* Разница между L 100 значений для Вистар и DR являются статистически значимыми. Шапиро-Wilk нормальность тест пройден (р = 0,588); равных Испытание прошло отклонений (р = 0,237).
L 100 = Внутренний диаметр установлен соответствующий сегмент целевой трансмурального давления.
X 1 = микро настройку позиционера необходимо растянуть установлен судна нормированной внутренней окружности (т.е. значение микрометра чтения, на которых были проведены эксперименты).
R 2 = коэффициент регрессии для приступе (X я, Y я) для экспоненциальной кривой.
NB: подробная процедура описана в руководстве по 510A Система Myograph 6.
Таблица 1. Пример считывания нормализации параметров брыжеечной артерии из сегментов линии Вистар, DS и DR из основных программа, показанная в "Нормализация Меню". Значения средства (± SEM) от 5 животных. * Различия между L 100 значений для Вистар и DS являются статистически значимыми (р <0,05).
| Вистар | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Таблица 2. Развитые напряженности (MN) в брыжеечных артерий изолированы от линии Вистар, DS и DR крыс, следующие приложения 5 мкМ PE для каждого судна. Значения представляют собой средства (± SEM) из 6-8 животных. * Значительно отличается от линии Вистар контроля (р <0,05).
Рисунок 1. Ca 2 + е-индуцированной релаксации PE-контракт брыжеечной артерии крысы Вистар установлен в проволоку myograph в физиологическом растворе соли, содержащей 1 мМ Ca 2 +. Артерия была уравновешенной в течение 30 мин при 37 ° С с постоянной аэрации и ответы на Ca 2 + е определен. Представитель сил трассировки при добавлении 5 мкМ PE следуют кумулятивные дополнения Са 2 +, показано на рисунке.
Рисунок 2. Ca 2 + е-индуцированной релаксации PE-контракт брыжеечной артерии крысы DS установлен в проволоку myograph в физиологическом растворе соли, содержащей 1 мМ Ca 2 +. Артерия была уравновешенной в течение 30 мин при 37 ° С с постоянной аэрации и ответы на Ca 2 + е определен. Представитель сил трассировки при добавлении 5 мкМ PE следуют кумулятивные дополнения Са 2 +, показано на рисунке. Са 2 + отдых был сильно скомпрометирован в этой ткани по сравнению с теми из Вистар и крыс DR.
Рисунок 3. Ca 2 + е-индуцированной релаксации PE-контракт брыжеечной артерии от крыс DR устанавливается в проволоку myograph в физиологическом растворе соли, содержащей 1 мМ Ca 2 +. Артерия была уравновешенной в течение 30 мин при 37 ° С с постоянной аэрации и ответы на Ca 2 + е determined.A представитель силу трассировки при добавлении 5 мкМ PE следуют кумулятивные дополнения Са 2 +, показано на рисунке.
Рисунок 4. А. [Са 2 +] е-ответ кривые. Б. Гистограмма показывает EC 50 для релаксации определяется путем подгонки данных четыре параметра логистической выражение curve.C.CaR в брыжеечных аркад изолированы от DR и DS крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гипертония является одной из основных причин сердечно-сосудистых, церебральных и почечных заболеваемости / смертности. Возникновения гипертонии высок среди населения и соль-чувствительной гипертонии особенно высока в старение населения, и более распространенным в черных, чем белых. Это, как полагают, связано с тенденцией черных сохранить натрия в почках 9. Солт-чувствительность является одним из основных факторов, способствующих болезни почек и ассоциируется с эндотелиальной дисфункции, но механизм до конца не изучен. Недавние исследования в нашей лаборатории показали, что высокие диеты соль снижения тканевой жидкости концентрации Са 2 + ([Ca 2 +] ИФ), и увеличение систолического давления в соль-чувствительных крыс 10,11. Эти эффекты могут быть отнесены к снижению выражение автомобилей в брыжеечных артерий и kidneys.Finding аналогичные сокращения в ЦАР уровней в соль-чувствительных пациентов с артериальной гипертонией может обеспечить мишенью для разработки новых методов лечения. Мы используем автоматизированные миография провод с изолированными брыжеечной артерии от количества животных моделей для изучения гипертонии сосудистой реактивности к Са 2 + е, чтобы понять механизм CaR сигнализации в сосудистой сети.
[Са 2 +] е поддерживается в узком диапазоне (1,1 - 1,4 мм) в организме человека 12, следовательно, автомобиль должен быть в состоянии обнаружить небольшие изменения [Са 2 +] е для активации рецептора возможным. На самом деле, автомобиль был показан для обнаружения небольших изменений в Ca 2 + е 13, и небольшое увеличение [Са 2 +] ЕСЛИ, которые находятся в физиологическом диапазоне 14. Натурные исследования микродиализа измерения [Са 2 +], если в двенадцатиперстной кишки и почек подслизистой коры, два тканей, которые имеют важное значение для регуляции периферического сопротивления и артериального давления (АД), показали, динамические изменения в зависимости от просвета кишечника [Са 2 +]. Увеличение кишки [Са 2 +] от 0 до 6 мм, увеличение [Са 2 +] ЕСЛИ от 1,1 до 1,9 мм 4,5,15, который находится в диапазоне, наблюдаемом для активации периваскулярных CaR нерва 16, и расслабиться изолированы брыжеечной артерий 17. Мы также показали, что автомобиль обнаруживает снижение [Са 2 +] е и увеличение продолжительности потенциала действия через активацию неселективных катионных каналов, которые, в свою очередь, ослабляет влияние на вероятность выпуска на неокортекса клеммы 18. Это говорит о том, что автомобиль обеспечивает пресинаптических обратной связи изменять возбудимость мозга в ответ на Са 2 + е. Кроме того, десенсибилизации CaR НДС возникает при повторном, длительная стимуляция 16, предполагая, что понимание регулирования этого рецептора будет уточнить его роль как при нормальных и гипертонической условиях. Bukoski и его коллеги показали, что небольшие изменения [Са 2 +] ЕСЛИ достаточно, чтобы активировать CaR и внести вклад в синтез сосудорасширяющих при нормальных условиях 3,4.19. Основываясь на этих наблюдениях, мы считаем, что этот ответ также будет происходить в условиях повышенного тонуса сосудов, как показано на гипертонию и поэтому может быть использована для контроля артериального давления. Изучение CaR активации и как это приводит к фосфорилированию сигнализации промежуточных Таким образом, необходимо, чтобы исследовать его роль в нормальной и гипертонической физиологии. Автомобиль G-белком рецептор (GPCR) и регулируется с помощью аналогичных механизмов, как другие GPCR, которые являются общими терапевтическими целями. Таким образом, понимание механизмов его регулирования в кровеносных сосудах предоставит полезные данные, чтобы определить его потенциал в качестве мишени для антигипертензивной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Проекта, описанного была поддержана премии номера R01 HL064761, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 и P20 MD000175 формы Национальных Институтов Здоровья. Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph. DMT Danish Myo Technology. , (2004).
- Angus, J. A., Wright, C. E. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. J. Physiol. 275, 85-101 (1978).
- Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. Differences in hypertension between blacks and whites: an overview. Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).
- Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. Action of thiazide on renal interstitial calcium. Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).
- Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats. Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).
- Hurwitz, S. Homeostatic control of plasma calcium concentration. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).
- Brown, E. M., MacLeod, R. J. Extracellular sensing and extracellular calcium signaling. Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).
- Breitwieser, G. E. Extracellular calcium as an integrator of tissue function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).
- Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries. Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).
- Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation. Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).
- Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D.
- Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).
- Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals. PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).
- Bukoski, R. D. The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis. Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).
- Bukoski, R. D. Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular. 16, 218-221 (2001).
