Summary
Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.
Abstract
Imagens de células ao vivo dinâmica permite a visualização direta de tempo-real interações entre as células do sistema imunitário 1, 2, no entanto, a falta de controle espacial e temporal entre a célula fagocítica e micróbio tornou foco observações sobre a interação inicial de resposta do hospedeiro a patógenos difícil. Historicamente, os eventos de contato intercelular tais como fagocitose 3 foram fotografadas pela mistura de dois tipos de células, e depois continuamente digitalização do campo de visão para encontrar serendipitous contatos intercelulares no estágio apropriado de interação. A natureza estocástica desses eventos torna este processo tedioso, e é difícil de observar eventos cedo ou fugazes em contato célula-célula por esta abordagem. Este método requer encontrar pares de células que estão à beira de contato, e observá-los até que entre em contato com consumado, ou não. Para lidar com essas limitações, nós usamos a captura óptica como um método não invasivo, não-destrutivo, mas rápido e eficaz para a posição células em cultura.
Armadilhas ópticas, ou pinças ópticas, estão cada vez mais utilizados em pesquisa biológica para capturar e manipular fisicamente as células e outros micro-empresas partículas em três dimensões 4. Pressão de radiação foi observada pela primeira vez e aplicada a sistemas de pinça óptica em 1970 5, 6, e foi usado pela primeira vez para controlar espécimes biológicos em 1987 7. Desde então, a pinça óptica amadureceram em uma tecnologia para sondar uma variedade de fenômenos biológicos 13/08.
Nós descrevemos um método de 14 que avanços ao vivo imagens de células através da integração de uma armadilha óptica com spinning microscopia confocal de disco com controle de temperatura e umidade para fornecer controle espacial e temporal requintada de organismos patogênicos em um ambiente fisiológico para facilitar a interação com células hospedeiras, como determinado pelo operador. Live, organismos patogênicos, como Candida albicans e Aspergillus fumigatus, que pode causar potencialmente letal, infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos 15, 16 (por exemplo, AIDS, quimioterapia e transplante de órgãos doentes), foram presos opticamente usando intensidades não-destrutivo a laser e mudou-se junto ao macrófagos, o que pode fagocitam o patógeno. De alta resolução, transmitido filmes de luz e de fluorescência baseada estabelecida a capacidade de observar os primeiros eventos de fagocitose em células vivas. Para demonstrar a ampla aplicabilidade em imunologia, principais células T também foram presos e manipulados para formar sinapses com anti-CD3 microesferas revestidas in vivo, e lapso de tempo de imagem de formação de sinapses também foi obtida. Ao fornecer um método para exercer o controle de patógenos espaciais bem viver com respeito às células imunológicas, as interações celulares podem ser capturados por microscopia de fluorescência com perturbação mínima para as células e pode render uma visão poderosa em respostas iniciais de imunidade inata e adaptativa.
Protocol
1. Condições de cultivo de patógenos para a captura óptica
- Crescer A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) em uma mídia semi-sólido de ágar contendo SBD (Sabouraud dextrose) a 30 ° C durante 3 dias.
- Crescer C. albicans (SC5314) em YPD (Yeast-peptona Dextrose) de cultura líquido contendo 100 mg / mL ampicilina durante a noite em uma incubadora shaker a 30 ° C.
2. Preparação de agentes patogênicos para a rotulagem fluorescentes
- Colheita desejada quantidade de patógenos e transferir para um tubo de reação 1,5 mL.
- Adicionar mL 300 de tampão fosfato (PBS) ao tubo de reação.
- Sonicate mistura por 30 segundos.
- Centrifugar a 4000 rpm por 1 minuto.
- Aspirar o sobrenadante, deixando pellet imperturbável.
- Repita (2.4) e (2,5) mais duas vezes.
- Ressuspender em 500μL de PBS.
3. Rotulagem de patógenos com corante fluorescente
- Dissolver 1 mg de corante de interesse (por exemplo, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) em 100 mL dimetilformamida (DMF) (concentração de 10 mg / mL).
- Adicionar 3 mL da mistura de corante para tubos de reação contendo patógenos lavada.
- Girar ou agitar amostra a 37 ° C por 1 hora.
- Lavar amostra com PBS 3X por centrifugação a 4000 rpm por 1 minuto.
- Ressuspender em 300 mL de PBS.
4. A colheita de células T do sangue total
- Obtenção de sangue total (fresco).
- Sangue quente, PBS + 2% de soro fetal bovino (FBS), e Histopaque à temperatura ambiente.
- Adicionar CD4 + T RosetteSep Human Enrichment Cocktail celular a 50 mL / mL de sangue total.
- Rode a amostra e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Diluir a amostra com igual volume de PBS + 2% de SFB e misture delicadamente.
- Camada de amostra diluída em cima do Histopaque, minimizando mistura
- Centrifugar por 20 minutos a 1200 xg à temperatura ambiente com o freio.
- Remover as células enriquecido.
- Lavar as células com PBS enriquecido 2x + solução FBS 2%.
- Lisar as células vermelhas do sangue durante 2 minutos com vermelho tampão de lise de glóbulos
- Adicionar 10 mL de PBS + 2% de SFB e lisadas centrífuga células vermelhas do sangue a 1500 rpm por 5 minutos
- Aspirar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o pellet
- Ressuspender em media IMDM contendo 10% de soro fetal bovino
5. Preparação de macrófagos RAW 264,7 em slides câmara
- Prepare DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle) para conter 10% de SFB, 1% de penicilina / estreptomicina, e 1% L-glutamina.
- Media quente, tripsina e PBS em banho quente a 37 ° C.
- Lavar 2x placa com PBS
- Aspirar PBS entre cada lavagem.
- Adicionar 5 mL de tripsina a placa de cobertura da superfície (para a 10 centímetros placa de cultura de tecidos).
- Incubar por 5 min a 37 ° C.
- Suavemente knock lado da placa para retirar as células da superfície da placa. Tenha cuidado para não espirrar tripsina fora do prato.
- Adicionar 5 mL ou quantidade equivalente de mídia para tripsina.
- Aspirar a mistura em um tubo de reação.
- Centrifugar a 1000 xg por 3 minutos.
- Media aspirado, cuidado para não perturbar o sedimento.
- Ressuspender em 10 ml de mídia.
- Adicionar 400 mL de mídia para cada uma das câmaras do slide câmara.
- Adicionar 5 mL de suspensão celular para cada câmara.
- Crescer durante a noite em estufa a 37 ° C com 5% de CO 2.
6. Além de patógenos para amostra
- Pipete 10/05 de patógenos rotulados de interesse (dos passos 1-3) na câmara.
- Misturar bem por pipetagem cima e para baixo, cuidado para não tocar o fundo da câmara de perturbar os macrófagos aderidos.
7. Carregamento de amostras para spinning microscópio confocal de disco (em vídeo, digitalização através de componentes)
- Ligue todos os componentes para spinning microscópio confocal de disco.
- Microscópio para alinhar imagens DIC.
- Remover slide câmara da incubadora.
- Inserir slides em câmara de estágio especializado.
- Remover topo da câmara de corrediça (necessário para geração de imagens DIC).
8. Preparação para a captura óptica (em vídeo, digitalização através de componentes e como ele é integrado em microscópio)
- Ligue obturador para armadilha óptica.
- Ligue IR laser.
- Obturador aberto (no laser) para armadilha óptica.
- Confirmar obturador na frente de IR laser é fechado, verificando com cartão de IR.
9. Seleção e manipulação de patógeno com armadilha óptica
- Concentre-se em macrófagos no slide aderido.
- Encontrar patógenos livremente flutuante em solução adjacente a macrófagos.
- Mova estágio tal que o patógeno é nas proximidades da armadilha.
- Obturador aberto e se engajar na armadilha.
- Mova amostra para trazer macrófagos em contato com a armadilha estacionáriapatógeno ped.
- Imagem com spinning microscópio confocal de disco, seja em DIC, fluorescência, ou combinação de ambos. Tipicamente, prendendo é feito em DIC, e imagens em tempo real é feita com fluorescência.
10. Resultados representativos:
Para exercer o controle espacial e temporal total de patógenos e contas em um in vivo e in vitro ambiente, nós projetamos um aparelho de captura custom-built integrados em um microscópio confocal disco giratório (esquemático mostrado na Figura 1.). Em plena força, o laser forneceu 350 mW de potência e após o acoplamento da luz com os diversos componentes ópticos no aparelho de armadilha óptica, ~ 80 mW de potência, no objetivo TIRF, medida com um medidor de potência, foi usado para formar a armadilha na câmara.
, A fim de posicionar um objeto na câmara em relação ao objeto preso, o palco foi movido, mantendo o objeto preso estável, com o laser de aprisionamento. O palco foi movido em velocidades lentas o suficiente, de modo que a força de arrasto sobre a partícula preso não exceder a força máxima armadilhas.
Populações separadas de C. albicans (tamanho típico - ~ 5 mm) foram marcados com cada uma das três cores (AF488, AF568, AF647 e, correspondente ao verde, azul e vermelha na figura, respectivamente) para ilustrar de imagem com múltiplos canais de fluorescência ao mesmo tempo visualmente prendendo o patógeno. A única C. albicans foi preso e transferido em um padrão quadrado por meio de um aglomerado de outra levedura, conforme indicado pelas setas cinza, demonstrando a capacidade de capturar e manipular a localização específica de um único patógeno escolhido pelo operador mesmo em um ambiente aglomerado (Fig. 2A) .
Para ilustrar ainda mais a flexibilidade deste sistema para prender as morfologias forma diferente exibido por organismos patogênicos, a pinça óptica também foi capaz de segurar e situar um C. albicans de partículas com um pseudo. O C. albicans rotulados com AF647 (vermelho) foi movido ao longo de uma trajetória descrita pela seta branca e colocado ao lado de células GFP-LC3-RAW fluorescente (Fig. 2B). A porção de fermento da C. albicans foi preso como o pseudo arrastou junto.
Nós também posicionados Aspergillus fumigatus ao lado de uma célula do rato macrófagos RAW, a fim de analisar a estrutura de tempo absoluto de fagocitose com esta linha celular particular e patógeno (Fig. 3A). Uma vez que o patógeno entra em contato com a célula, a armadilha é desligado, e lapso de tempo de imagem é utilizado para observar os eventos subseqüentes celular (Fig. 3B). A armadilha óptica também foi usado para captação primária células T isoladas do sangue e dirigido adjacentes aos grânulos revestidos com anticorpo anti-CD3 para que as células T para formar uma sinapse imunológica com o talão (Fig. 4), mostram o adicional versatilidade diretamente armadilha e manipular células imunitárias.
Figura 1. Descrições e esquemática de armadilha óptica combinada e girando disco de instalação do microscópio confocal. Layout do instrumento mostrando o feixe de captura (roxo), caminho para a iluminação de campo claro de imagem (laranja), feixe de excitação de fluorescência (vermelho), emissão de fluorescência (verde), charge-coupled device (CCD) da câmera, elétron-multiplicando dispositivo de carga acoplado (EM- CCD da câmera), espelhos dicróicos (D1 e D2), espelhos (M1 e M2) e lentes (L1, L2, L3, L4). Todos os outros componentes do sistema de microscópio confocal armadilha são rotulados na figura.
Figura 2. (A) imagens de fluorescência de presos e manipulados C. albicans. Um preso fluorescente marcado organismo (Alexa Fluor 488 (AF488), azul) em um campo de outros C. fluorescente marcado albicans (AF568, AF647 verde e vermelho). O estágio é movido em torno da partícula presa CA, azul, conforme indicado pelas setas cinza. (B) Preso forma pseudo-hifas de C. albicans ao lado de GFP-LC3 células RAW. Fluorescente etiquetado forma psuedohyphal de CA (vermelho, AF647) opticamente preso e mudou-se junto ao GFP-LC3 expressa macrófagos RAW. O organismo CA é movido ao longo da trajetória como indicado pela seta branca.
Figura 3. Trapping e posicionamento de A. fumigatus ao lado de uma célula fagocitária RAW. (A) Brightfield imagens de um preso A. fumigatus, como indicado pela seta branca, movido e posicionado ao longo do caminho, como indicado pela seta vermelha. O patógeno é preso ligeiramente fora de foco devido à armadilha empurrando o organismo ligeiramente acima do plano focal. A. fumigatus é movido até que ele é colocado ao lado da célula desejada RAW. (B) Fluimagem orescence de fagocitose de A. fumigatus por célula RAW. Após o patógeno preso é colocado próximo a uma célula RAW, o processo de fagocitose é ativado. Em 30 s, a membrana da célula RAW começa a mudar e formar um copo ao redor da partícula. Em 60 s, o copo está completamente formado. De 90 a 150s, a A. fumigatus é engolida, e por 180 s, a partícula é totalmente internalizado
Figura 4. Trapping primários de células T para formar sinapses com anti-CD3 grânulos revestidos. DIC imagens de um primário de células T movido pela armadilha óptica para uma posição ao lado de um cordão revestido com anticorpo anti-CD3. A célula, então, forma uma sinapse imunológica, que não pode ser facilmente percebido nas imagens.
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Discussion
Neste trabalho nós usamos uma armadilha óptica para capturar patógenos com dimensões entre 3 mm - 5 mm. Apesar de patógenos de interesse para o nosso laboratório normalmente têm estas dimensões, o sistema de pinça óptica aqui descrito é flexível para capturar uma grande variedade de tamanhos. Na verdade armadilhas ópticas têm sido usados para capturar partículas que variam de átomos individuais para as células de aproximadamente 10 m de diâmetro. Além disso, este sistema de captura óptica foi capaz de capturar partículas de várias formas: esférica, elíptica, e partículas extremamente alongada, que é útil quando se trabalha com patógenos biológicos.
Com esta formação fagocitose método e sinapse, em tempo real, foram investigados, e as mudanças estruturais na superfície celular foi analisada. Por partículas de posicionamento ao lado de uma célula, patógenos vivos foram controlados e manipulados para ativar a maquinaria fagocíticas e estudar a resposta imunológica em células vivas e monitorar o início absoluto de um evento através de todo o curso da fagocitose. Como resultado, toda a evolução dos acontecimentos fagocíticas e máquinas podem ser medidos com precisão. Seguimos fagocitose de A. fumigatus que o patógeno é colocado ao lado de um macrófago, e observou as mudanças membrana inicial como a partícula foi engolida. Fomos capazes de medir com precisão o tempo todo este processo por meio do controle quando queríamos que o processo para iniciar com a colocação do patógeno. Esta técnica também foi estendido para observar a formação de sinapses por principal células-T. A pinça óptica movida uma célula T ao lado de um anticorpo anti-CD3 talão revestido, e formação de sinapses podem ser observados em tempo real.
Ao nosso conhecimento, este método é o primeiro a controlar e manipular um patógeno ao lado de uma célula fagocitária, e em conjunto com a microscopia confocal, foi usado para gravar e visualizar o princípio absoluto e no final de fagocitose em três dimensões com difração limitada espaço- resolução temporal. A tecnologia também foi utilizada para controlar e manipular as células T primárias para o estudo das sinapses imunológicas, ilustrando a versatilidade deste instrumento para uma variedade de aplicações biológicas. Nosso sistema oferece cinco comprimentos de onda de excitação, incluindo excitação UV, permitindo que imagens de uma variedade de fluoróforos. O aparelho captura ocupa uma pegada de 4,5 pés 2, capaz de ser integrado em muitos microscópios convencionais de epifluorescência e confocal. Embora este instrumento foi projetado principalmente para manipulação de objetos, modificações futuras incluiria maior poder de laser, as capacidades de detecção talão posição, etc permitiria a caracterização de forças biomecânicas na interação célula-patógeno.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Massachusetts General Hospital Departamento de Fundos de Medicina Interna (JMT, MKM, MLC, JMV), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia conceder T32EB006348 (CEC), Centro de Massachusetts General Hospital para financiar Computacional e Integrative Biology desenvolvimento e AI062773 ( rjh), concede AI062773, DK83756, e DK 043351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), e Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI057999 (JMV ). Agradecemos a Nicholas C. Yoder para discussões úteis, e Charles Felts (RPI, Inc.) para obter assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon Instruments | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon Instruments | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
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