Summary
우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.
Abstract
바이러스는 세포 의무 기생충이며, 따라서 그들의 DNA의 연구는 거리 숙주 세포 오염 물질과 DNA에서 바이러스 물질을 격리가 필요합니다. 여러 다운 스트림 응용 프로그램이 프로토콜에 의해 제공됩니다 순수 바이러스 DNA의 다량을 필요로합니다. 이러한 응용 프로그램은 바이러스성 게놈 호스트 DNA의 제거 바이러스는 시퀀스에 대한 데이터 출력을 최적화하는 데있어 매우 중요합니다 시퀀싱, 그리고 새로운 바이러스 재조합 종자의 생산, 플라스미드 및 선형 바이러스 DNA가 재조합을 용이하게 정화의 공동 transfection. 1,2를 포함 3
이 절차는 extractions와 감염된 세포에서 선형 herpesvirus nucleocapsid DNA를 정제 분리 밀도 기반 원심 분리의 조합을 활용합니다. 4,5 초기 정화 단계 extractions 및 원심 분리 단계 동안 바이러스 DNA를 포함하고 보호하는, 정화 바이러스 capsids을 분리하는 것을 목표로 세포 단백질과 DNA를 제거하는 것이. nucleocapsids의 용해 다음 바이러스 DNA를 출시, 두 최종 페놀 - 클로로포름 단계는 남아있는 단백질을 제거합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 1.90의 평균 OD 280분의 260과 고농도 순수합니다. 사용 감염된 세포, 150-800 μg 이상에서 바이러스성 DNA 범위의 수율의 수량에 따라 다릅니다. 이 DNA의 순도는 4C에서 장기 보관 동안 안정합니다. 이 DNA는 따라서 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응 및 transfections에 적합합니다.
이전 프로토콜을 처음으로, 그것은 요리 당 세포 (예 합류 15cm 접시에 8 X 10 6 PK - 15 세포의 평균) 및 바이러스 주식의 titer를 사용하는 (의 평균 숫자를 아는 것이 중요합니다 ML 당 예 : 1 X 10 8 플라크 형성 단위 -). 이들은 프로토콜에 대한 감염의 적절한 다중성을 (뫄) 계산이 필요합니다. 예를 들어 6, 뫄 5시 위 바이러스 주식과 PK - 15 세포 중 하나 15cm 접시를 감염시킬, 당신은 400 μl를 사용하는 것입니다 매체의 3.6 ML (한 15cm 플레이트 4 ML 총 접종 볼륨)로 바이러스 주식을 희석.
여러 바이러스성 DNA의 준비가 동시에 준비하실 수 있습니다. 동시 준비의 개수는 초원 심 분리기의 회전자에 의해 개최 튜브의 숫자로 제한됩니다 (바이러스 당 하나, 아래 단계 3.9 참조). 여기 한 바이러스에 완료되는 것처럼 절차를 설명합니다.
Protocol
1. 첫날 : 바이러스성 감염 및 버퍼의 작성
- 감염에 대한 조직 배양 세포의 50-10 요리 (15cm 직경)를 준비, pseudorabies 바이러스 (PRV) 또는 헤르페스에 대한 베로 세포에 대한 예 : PK - 15 세포 (HSV) 바이러스를 단순.
- 세포가 95 때 - 100 % 합류의 (뫄) 50-10에 그들을 감염. 이렇게하려면 강판 당 4 ML의 총 볼륨에서 바이러스 주식을 사용하여 각 접시를 예방하고 37에서 1 시간 동안 접시를 품어 ° C. 록 번호판 부드럽게 매 15 분 셀 monolayer은 바이러스에 의해 완전히 inoculum 코팅 유지할 수 있습니다. 한편, 다음 단계에 대한 매체를 따뜻하게.
- 감염 한 시간 후, 접시에서 바이러스 inoculum을 대기음 따뜻한 중간 15 ML을 추가하고, 37 품어 ° C를 humidified 인큐베이터에 12~20시간하십시오.
- LCM 버퍼 (표 1 참조)과 ° C 철저하게 믹싱을위한 4 박 바위를 준비합니다. (표 2 참조) 바이러스의 DNA resuspension에 대한 TNE를 준비합니다.
2. 둘째 날, 1 단계 : 세포 용해와 Ultracentrifugation
- 시각 그 세포의 감염이 균일한 cytopathic 효과 (CPE)를 발생했습니다 확인합니다. 모든 세포가 반올림지만, 접시에서 해제하지 않은까지 감염이 진행하도록 허용합니다.
- 매체에 감염된 세포를 긁어, 50 ML 원뿔 튜브에 세포와 매체를 결합. .이 단계에 필요한 원뿔 튜브의 개수가 위의 단계 1.2 감염에 사용되는 요리의 개수에 따라 달라집니다, 예를 들어 한 50 ML 원뿔 튜브는 각 옵션 15 ML 매체 3 요리의 최대 펠렛하는 데 사용할 수 있습니다 린스 10 ML PBS와 번호판과 세포와 매체와 결합.
- 원심 분리기 세포와 실온에서 2,000 상대 centifugal 힘 (RCF)에서 10 분 동안 매체는 다음 뜨는 기음과 PBS의 10 ML 각 펠렛을 resuspend. 한 바이러스 감염의 펠렛이 단계 2.2의 여러 원뿔 튜브에 퍼져 있었다면, 다음이 단계에 하나의 원뿔 관에 recombined 수 있습니다. 원심 분리와 열망을 반복 옵션 :.이 펠렛은 -20 ° C에서 보관 및 프로토콜은 나중에 계속있을 수 있습니다.
3. 둘째 날, 2 단계 : Ultracentrifugation
다음 단계 동안 세포 펠릿 가능한 얼음 LCM 버퍼 때마다 보관하십시오.
- 0 % 글리세롤로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가 - LCM 버퍼. 그것을 설정하여 초원 심 분리기 (아래 단계 3.9)을 냉각 시작 4 ° C와 진공 켜기.
- 그것이 더 이상 clumpy 없을때까지 버퍼 LCM - 0 % 글리세롤 5 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend. 튜브 어떤 소화 되 다만 세포 펠렛을 해산시키기 위해 필요할 경우, 소용돌이.
- 1.5 ML의 프레온 (1,1,2 - trichloro - 1 ,2,2 - trifluoroethane)을 추가하고 적극적으로 vortexing하여 압축을 풉니다. 즉시 4 ° C.의 온도에서 2000 RCF 10 분 원심 분리기 넓은 구멍 피펫 팁 (인터페이스를 피하)와 상위 레이어를 수집하고 새로운 튜브를 선택하기 위해 전송 :. 펠렛은 젤라틴 고체 경우, 신속하게 새로운 튜브로 가기 레이어를 부어 수 있습니다.
- 프레온 추출을 반복하고 다시 원심 분리기.
- 상단 레이어 (~ 5 ML)를 수집하고 새로운 polyallomer의 초원 심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. LCM 버퍼 - 남은 두 글리세롤로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다.
- LCM (중간 층), 그리고 45 % 글리세롤 2.5 ML로 다시 underlaying - - LCM (아래 층) 5 % 글리세롤 3 ML과 프레온 추출물 (상단 레이어)를 underlaying하여 polyallomer의 원심 관에 그라디언트를 준비합니다. 튜브 내용의 오버플로우를 방지하기 위해 얇은 피펫을 사용합니다.
- 필요한 경우, LCM 버퍼의 동일한 비율을 사용하여 동등한 균형 튜브를 준비합니다.
- 초원 심 분리기의 버킷으로 튜브를 전송합니다. 상단 레이어 (한 번에 ~ 50-100 μl)로 LCM 버퍼 - 부드럽게 추가 0 % 글리세롤을 추가하여, 서로의 0.1 g 이내에 양동이를 균형.
- 수평 또는 스윙 버킷 회전자와 감기 초원 심 분리기를 사용하여 4 ° C.의 온도에서 77,000 RCF (SW41Ti의 로터 예 : 25,000 RPM)에서 1 시간 동안 균형 샘플을 스핀
- ultracentrifugation 동안 에탄올 침전 단계 (아래 4.6)에서 부동의 DNA를 캡처하는 유리 후크합니다. 유리 파스퇴르 pipet의 양쪽 끝을 잡고 불꽃을 통해 중간 부분을 일시 중지합니다. 유리의 섹션이 거의 용융되면, 유리 스트레칭 부드럽게 당겨 단단히 직각 갈고리 (<90도)을 만들 수 부드럽게 구부하고 끝 봉쇄하기 위해 급격하게 당기십시오. 유리 후크의 일각이 열려 있으면 유리 그것을 가까운 정도로 녹아 있도록 불꽃 위에 팁을시오.
- ultracentrifugation 후, 당신은 한 가운데에있는 어두운 장소와 얇은 불투명 펠렛 나타납니다. 조심스럽게 측면을 따라 drippings 등 관에서 액체를 대기음하지만 튜브 하단의 펠렛을 피하고.
- 상온에서 0.5 ML의 TNE를 추가합니다.
- 펠렛은 펠렛의 수화를 허용하도록 적어도 10 분 동안 앉아 보자. Optional : 4 보관하면 펠렛도 밤새 TNE에 resuspend 수 있습니다 ° C.
4. 제 일 : "유령"의 DNA 강수량
- 작은 구멍 피펫 팁 (예 : p200 피펫 팁)로 pipetting하여 펠렛을 휴식. 바이러스 DNA가 아직도이 시점에서 capsids에 포함되어 있기 때문에,이 단계에서 전단 걱정하지 마십시오. capsids을 파괴하기 위해 상온에서 바이러스 펠렛을 포함한 튜브 다음 시약을 추가합니다 :
- 4.25 ML TNE
- 0.25 ML 10% SDS
- 이 MG Proteinase K
에 여기에서 전단주의, 예를 들어 큰 구멍 pipettes를 사용하여 바이러스 물질에게 소용돌이하지
- 페놀 - 클로로포름 5 ML를 추가하여 바이러스 단백질을 추출하고 즉시 유제를 유지하는 반전이나 vortexing 시작합니다. 10 초 동안 혼합 후, 실온에서 2000 RCF에서 5 분 동안 감광 유제를 원심 분리기. , 넓은 구멍 피펫 팁로 가기 레이어를 수집 인터페이스를 피하기 위해, 새로운 튜브로 전송 옵션 :.이 단계에서 사용 위상 잠금 젤 (PLG) 튜브 인터페이스에서 오염을 피할 수 있습니다.
- 페놀 - 클로로포름 추출을 반복하고 다시 원심 분리기.
- 두 번째 페놀 - 클로로포름 추출 후 30 ML 유리 Corex 튜브로 가기 레이어를 수집하고 10~15분위한 -20 ° C에서 튜브를 진정, 그것이 정지하지 않는주의한다.
- 얼음처럼 차가운 에탄올 10 ML 추가 튜브 (맨 위에 Parafilm M의 부분을 스트레칭하여 예) 커버하고, 즉시 섞어 반전. 얇은 끈적끈적하는의 석출물로 구성되어 나타나는 DNA '유령'에 대해보세요. 부드럽게 더 섞어 쓰는 DNA 함께 클러스터 precipitates 원인 튜브를 반전.
- DNA의 유령 (들)을 캡처하는 유리 후크를 사용합니다. 조심스럽게 초과 액체를 제거하기 위해 DNA를 얼룩 후, 1.5 ML 튜브에 후크를 (아래 팁) 장소 및 건조 수 있습니다. 0.25 추가 - TE 0.5 ML를 DNA의 유령을 해산합니다. 적어도 한 시간 동안 진행하는 DNA의 resuspension을 허용합니다. 4 스토어 DNA ° C. 옵션 : 1.5 ML 튜브에 유리 후크를 끊다, DNA의 수율을 최대화하려면, 유리 파편 떨어져 있도록 resuspension 시간이 지남에 계속할 수 있습니다.
5. 대표 결과
뫄 충분히 높은 통해 세포는 야생 형 PRV의 변종에 대한 ~ 18 시간 이후 감염 (hpi) 내에서 전체 CPE를 달성해야하고, 야생 형 HSV - 1 계통 (그림 1) ~ 24 hpi. 일단 감염된 세포 펠렛을 수확이고, 나머지 프로토콜 단계를 하나의 긴 하루 만에 완벽하게 하루나 이틀 (그림 2)을 통해 수행하실 수 있습니다.
DNA의 귀신을 캡처하는 유리 후크를 준비하면 나중에 그것이 1.5 ML 튜브의 기초 (그림 3)에 맞게 수 있도록 후크 각도가 90도 미만이어야 수 있도록하는 것이 중요합니다. 이 후크의 팁을 밀폐하면 pipet 내부 DNA 손실을 방지할 수 있습니다.
DNA의 유령은 침전 단계 중에 양식과 흰색, 끈적끈적하는 쓰레드 (그림 4)로 표시됩니다. 서로 및 / 또는 DNA를 캡처하는 데 사용되는 유리 후크 이러한 집계 및 막대기. 따라서 동일한 유리 후크는 강수량 솔루션 내에서 DNA의 여러 스레드를 수집하는 데 사용할 수 있습니다.
| 원하는 볼륨에 따라 열을 선택 : | 10 ML | 15 ML | 20 ML | 40 ML |
| 1M KCL | 1.3 ML | 1.9 ML | 2.5 ML | 5 ML |
| 1M 트리스 (산도 7.4) | 300 μl | 450 μl | 600 μl | 1.2 ML |
| 1M MgCl 2 | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| 0.5 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 10 μl | 15 μl | 20 μl | 40 μl |
| NP40/IGEPAL | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| β - 메르 캅 토 에탄올 (사용하기 전에 바로 추가) | 4.3 μl | 6.5 μl | 8.6 μl | 17.2 μl |
| 원하는 퍼센트 글리세롤 (0, 5, 또는 45 %)에 대한 비율을 사용 | ||||
| 0 % 글리세롤 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 |
| 물 | 8.3 ML | 12.5 ML | 16.7 ML | 33.4 ML |
| 5 % 글리세롤 | 0.5 ML | 0.8 ML | 1.0 ML | 2.0 ML |
| 물 | 7.8 ML | 11.7 ML | 15.7 ML | 31.4 ML |
| 45% glycerol | 4.5 ML | 6.8 ML | 9.0 ML | 18.0 ML |
| 물 | 3.8 ML | 5.7 ML | 7.7 ML | 15.4 ML |
표 1. LCM 버퍼의 준비를위한 조리법
| 50 ML 량 |
| 5 ML 1M NaCl |
| 2.5 ML 1M 트리스, 산도 7.5 |
| 1 ML 0.5 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) |
| 41.5 ML H 2 O |
표 2. TNE (; 50 MM 트리스, 산도 7.5, 10 MM 0.1 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) NaCl)의 준비
| 1 L 부피에 대한 |
| 0.2 g KCl |
| 0.2 g KH 2 PO 4 |
| 8g NaCl |
| 1.15g 나 2 HPO 4 |
| 1L로 H 2 O |
표 3. PBS (; 1.5 MM KH 2 PO 4; 137 MM NaCl, 8.1 MM 2 HPO 4 나, 산도 7.0 2.7 MM KCl)의 준비
그림 1. PK15 세포 감염 (A) 이전, 감염의 높은 다중성 후 (B) 미드웨이 감염을 통해, 그리고 (C) cytopathic 효과 (CPE)에서.
그림 2. 프로토콜의 개요.
그림 3. 유리 세 대표 사례는 바이러스 DNA의 유령을 수집하는 데 사용 후크.
그림 4. 잘 구성된 풍부한 DNA "귀신"의 대표적인 예라고 할 수 있습니다.
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Discussion
이 프로토콜의 일부는 원래 BSL4 조건에서 바이러스성 DNA의 격리를 위해 개발하지만, 그것은 비 - BSL 조건에 동등하게 잘 적응했다. 4 우리는 일반적으로 DNA의 genomes를 가지고있는 알파 - herpesviruses PRV과 HSV - 1에서 DNA를 분리하려면이 프로토콜을 사용 capsid와 지질 봉투에 둘러싸인 proteinaceous로 묶여. 7,8 그러나 포함 베타 및 감마 - herpesviruses과 adenoviruses, 가능성이 다른 큰 DNA 바이러스에 직접 적용할 수 있습니다. 비슷한 extractions는 일반적으로뿐만 아니라 RNA 바이러스에 사용됩니다 9.
포함되어있는 정화의 다양한 방법에서이 DNA 준비 가능성이 결과의 견고. 초기 프레온 extractions 변성의 지질 점막, 세포 구성 요소를 분리하고 또한 지질 봉투 및 herpesvirus의 capsids를 둘러싼 바깥쪽 외피 단백질을 발표. 이것은 심한 바이러스 nucleocapsids 펠렛 두 기울기 쿠션을 통해 효과적으로 대부분의 다른 휴대 전화 부품에서 그들을 분리 ultracentrifugation, 뒤에있다. 이러한 capsids은 resuspended되며, 바이러스 nucleocapsid DNA는 proteinase K의와 세제로 capsids을 rupturing 발표됩니다. 두 페놀 - 클로로포름 extractions 철저하게 nucleocapsid 부품 및 모든 나머지 세포 단백질을 제거합니다. 마지막으로, 솔루션의 대형 바이러스의 DNA genomes의 강수량은 소금이나 미립자 오염의 carryover를 줄여줍니다.
바이러스성 nucleocapsid DNA를 분리하고이 절차는 하류 어플 리케이션을위한 풍부한, 고순도 물질을 제공합니다. 여러 추출 및 원심 분리 단계의 결합은 DNA 10과 더 많은 세포 파편이나 저하 단백질 제품을두고 단순한 단일 추출 프로토콜에서 프로토콜을 구별. 단백질 오염 물질은 바이러스 DNA의 저장 안정성을 감소하고, 세포에 transfection 효율을 줄일 수 있습니다. 세포의 DNA 오염 물질은 부정적인 PCR 반응과 높은 처리량 시퀀싱 프로토콜에 영향을.이 프로토콜의 1의 DNA 수율이 잘 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석 및 모래 바닥 남부. 5,11 하나 nucleocapsid 준비에 적합한 충분한을 제공하고, 또한 높은 이러한 분석의 모든 자료.
감염에 사용되는 세포의 수량은 바이러스 DNA의 최종 수율 영향을 미칩니다. 야생 형 성장 속도, PK - 15 세포 (한 15cm 직경의 요리가 약 8 X 10 6 세포를 보유)의 50-10 요리의 입력과 PRV의 변종에 대한 일반적으로 바이러스의 DNA 250-500 μg을 산출. 전염성 virions의 감소 수율과 바이러스 돌연변이 경우, 입력 자료 위를 따라 크기를 조정해야합니다. 요리의 입력 번호를 배로하면 약 생산량을 두 번되며, 여기서 설명하는 시약과 동일한 수량과 함께 처리할 수 있습니다. 이 시점 이후의 입력을 증가하기 위해, 우리는 3.13 단계를 통해이 병렬 처리 스트림 (예 : 두 세포 알약 두 추출 튜브)에 입력 자료를 분리하는 것이 좋습니다. 같은 바이러스 변형의 두 ultracentrifugation 알약이 resuspension 단계에 하나의 튜브에 조합하여 사용할 수 있습니다. DNA가 깔끔하게 절차의 끝에 귀신을 형성하지 못하면, 기본 문제 해결 방법은 DNA의 수율을 증가와 석출을 향상시킬 세포의 입력 량을 증가하는 것입니다.
기타 조건도 유령 형성의 성공에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 시간이 바이러스 nucleocapsids이 풍부한하는 시점에서 감염의 수확을하는 것이 중요하지만, 주로 세포 또는 세포 관련입니다. 매체에 발표 Virions이 절차에 의해 캡처되지 않습니다, 따라서 너무 늦었 감염에 (CPE는 세포가 접시에서 분리 지점으로 진행되고있다 예) 세포를 수확하는 것은 잠재적인 DNA의 수율과 유령 형성을 줄일 수 있습니다. 완전히 다음의 추출 단계를 최대한 활용하려면 LCM 버퍼에 수확 세포 펠릿 (단계 3.2) 해산하는 것도 중요합니다, 세포 펠렛은 이전 단계에서 냉동되어있다면이 resuspension 더 많은 시간과 관심이 필요합니다. 사소한 절차 세부 사항뿐만 아니라 DNA의 수율에 영향을 미칩니다. 3 단계와 4 단계는 냉각 솔루션을 사용하고 얼음에있는 모든 튜브를 유지하지 않고 진행 할 수 있지만, DNA의 대충의 성공률은 시약이 추위 보관하면 훨씬 높다. 마찬가지로 솔루션 시간이 지남에 따라 감소하고, 따라서, 사용의 감소 용량을 최적화 바로 전에 LCM 솔루션에 추가 단백질 중단을 향상시키고 DNA의 수율과 유령 형성을 증가의 β - 메르 캅 토 에탄올의 안정성. 이러한 세부 사항에 세심한주의 고품질 바이러스 DNA의 출력을 향상시킬 것입니다.
바이러스성 DNA가 점성 때문에, 그 결과 솔루션은 이기종 수 있습니다. 유리 후크에서 resuspension에 대한 더 많은 시간을 허용하면 유용한 DNA의 수율을 증가 및 솔루션 균질성을 향상시킵니다. 표준 분광 광도법DNA의 수율과 순도를 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. DNA의 fluorimetry는 DNA의 수율의 더 정확한 조치 (예 : Invitrogen PicoGreen dsDNA가 얼룩)을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자 그렉 스미스, 리사 Pomeranz, 매트 라이먼, Marlies 엘드리지, Halina Staniszewska Goraczniak하고, 조정이 프로토콜의 엔키 스트 연구실의 구성원의 기여에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
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