Summary
Al fine di valutare nuovi paradigmi terapeutici per il trattamento del glioma, fisiologica modelli pertinenti sono essenziali. Utilizziamo uno impiantabile procedura vite di guida per la creazione di modelli di xenotrapianto intracranica che è più rapido e più sicuro rispetto agli approcci stereotassica.
Abstract
L'innesto di cellule tumorali nel cervello di topi immunodepressi è un metodo consolidato per lo studio dei tumori cerebrali tra cui glioblastoma (gliomi) e il medulloblastoma. L'approccio stereotassico ampiamente utilizzato consente solo per l'iniezione di un singolo animale in un momento, è laborioso e richiede attrezzature altamente specializzate. Il metodo di vite guida, sviluppato inizialmente da Lal et al., 1 è stato sviluppato per eliminare le procedure stereotassiche ingombrante. Ora descrivere un approccio modificato vite guida che è rapido e straordinariamente sicura, entrambi i quali sono fondamentali considerazioni di carattere etico. In particolare, la nostra procedura ora incorpora una pompa per infusione che consente fino a 10 animali per essere iniettati contemporaneamente con le cellule tumorali.
Per dimostrare l'utilità di questa procedura, abbiamo stabilito cellule umane di glioma U87MG come xenotrapianti intracranica nei topi, che sono stati poi trattati con AMG102, un anticorpo completamente umano diretto a HGF / fattore di dispersione attualmente sottoposto a valutazione clinica 2-5. Iniezione sistemica di AMG102 prolungato in modo significativo la sopravvivenza di tutti i mouse con xenotrapianti U87MG intracranica e ha portato un certo numero di guarigioni complete.
Questo studio dimostra che il metodo vite di guida è un poco costoso, approccio altamente riproducibili per stabilire xenotrapianti intracranica. Inoltre, fornisce un modello fisiologici di rilievo per la convalida nuove strategie terapeutiche per il trattamento dei tumori cerebrali.
Protocol
1. Linee cellulari
- U87MG cellule di glioma sono coltivate in contenitori di grandi dimensioni coltura tissutale con DMEM-F12 integrato con 5% di siero fetale bovino (FBS).
- Le cellule vengono raccolte mediante lavaggio fiaschi due volte con fosfato caldo Soluzione salina tamponata (PBS) e l'incubazione a 37 ° C per 5 minuti con 10 ml di PBS contenente 0,25% tripsina e 0.05% EDTA. Una volta che le cellule sono alzata, sono posti in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di terreni di coltura e centrifugati (300 X g per 4 min).
- Dopo il lavaggio, le cellule sono risospese ad una concentrazione di 10 x 10 6 / ml in terreni di coltura, che ha consentito una inoculazione di 50.000 cellule / 5 microlitri.
- Le cellule sono tenuti in ghiaccio fino ad iniezione intracranica.
2. Guidavite intracranica bullonatura
Questa procedura può essere effettuata alcuni giorni prima l'iniezione di cellule. Tutte le procedure qui descritte sono state effettuate sotto stretto condizioni sterili.
- Topi (BALB / c nu / nu femminile; 5-6 settimane, circa 18g) sono numerati a scopo di identificazione, pesati e anestetizzati con un intraperitoneale (IP) iniezione di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg).
- La pelle è pulito con una soluzione di iodio e di una piccola incisione (2-3 mm) è realizzato lungo il lato destro della linea mediana e anteriore alla linea interaurale. Ciò espone le suture coronale e sagittale del cranio. Il bregma è posizionato alla confluenza di questi due punti di sutura.
- La vite di punto di ingresso guida viene poi segnato in un punto 2.5 mm lateralmente e 1 mm anteriormente al bregma. Questo punto si trova direttamente sopra il nucleo caudato 1.
- A x 1 1 foro mm di profondità si è esercitato con una mano sterile tenuta punta elicoidale attraverso il cranio alla dura.
- Una vite guida sterilizzato che si estenderà 1,6 millimetri sotto la superficie teschi in la dura viene quindi montata nel foro con un cacciavite fino a filo con il cranio (Figura 1A).
- Un mandrino sterili o manichino vite viene poi inserito nel foro centrale della vite guida per chiudere l'apertura (Figura 1B).
- La ferita è chiusa con adesivo tissutale Vetbond (n-butil-cianoacrilato) e il mouse sono un'iniezione intraperitoneale di reversine (piccoli animali) (0,1 ml / kg) e il carprofen (5 mg/kg/100 microlitri) per l'analgesia. I topi sono poi permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento (36 ° C) che possono accogliere fino a 20 minuti. I topi sono spesso monitorati e osservati durante questo periodo di recupero fino a quando non sono pienamente consapevoli.
3. Intracranica attecchimento cellulare
- Una siringa sterile ammanettato Hamilton è preparato mediante l'applicazione di un piccolo anello di plastica per la punta dell'ago consentendo solo 2 mm di estendere l'ago sotto la guida all'uscita della vite (Figura 1B). Il punto di inoculazione finale è quindi 3,5 millimetri sotto la superficie del cranio.
- Quattro giorni dopo l'intervento vite di guida, i topi sono di nuovo anestetizzati come sopra (2,1) e una piccola incisione è fatta sulla vite guida per rimuovere il mandrino.
- La siringa Hamilton ammanettato viene poi riempito con 5 ml di cellule in comune, tenendo bene le precauzioni per non creare o elaborare eventuali bolle d'aria.
- La siringa è fissata alla pompa di perfusione e l'ago viene inserito la vite di guida (Figura 1C). Le cellule sono poi infuse ad una velocità di 30 microlitri per ora.
- L'apparecchio automatico (Figura 1D) ci ha permesso di iniettare fino a 10 animali in un momento ad un flusso costante. Le cellule possono anche essere iniettato manualmente utilizzando la siringa ammanettato hamilton o in alternativa la siringa può essere ammanettato da una punta di 200 microlitri pipetta che è stato tagliato di 3 mm per consentire la punta dell'ago di estendere oltre la vite di guida da 2 mm. L'iniezione deve essere eseguita con un ritmo costante costante.
- Quando l'infusione è completa, la siringa è accuratamente rimosso e il mandrino è sostituito nella vite di guida. La ferita è incollato chiuso ei topi sono dati farmaci recupero come prima (2,7) e ha permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento.
4. Sfida terapeutica
- Quattro giorni dopo l'inoculazione di cellule U87MG, i topi sono pesati e divisi casualmente in gruppi di controllo e trattamento.
- Il gruppo di controllo è dato un intraperitoneale (IP) l'inserimento di PBS (100 l), mentre il gruppo di trattamento è dato una iniezione di AMG102 IP (100 mg in 100 ml di PBS).
- Le iniezioni vengono ripetute ogni due giorni per 14 giorni, per un totale di 6 iniezioni (Figura 2).
- Dopo l'ultima iniezione, i topi sono monitorati quotidianamente e pesati tutti i giorni secondo.
- Quando i topi cominciò a mostrare notevoli disfunzioni neurologiche (disturbi dell'equilibrio, paralisi), disidratazione, o perdita di peso superiore al 10% o moribondi, erano umanamente eutanasia. Questi umano end-point giorni sono stati poi registrati sulla curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza.
5. Valutazione di efficacia terapeutica
6. Rappresentante dei risultati:
Animali di controllo ha iniziato a mostrare segni di disturbi neurologici e perdita di peso 23 giorni dopo l'inoculo iniziale di cellule. Questo è stato significativamente ritardato nel gruppo AMG102 trattati per 35 giorni. Infatti di giorno 35, il 77% (n = 7 / 9) del gruppo di controllo era stata eutanasia. La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza dimostra chiaramente l'aumento significativo della sopravvivenza in risposta al AMG102 trattamento (Figura 3). Dal giorno 70, l'88% dei topi di controllo era stata eutanasia (n = 8 / 9) rispetto al 37% (n = 3 / 8) di AMG102 gruppo trattato. L'analisi istologica del cervello hanno confermato che tutti i 9 gli animali del gruppo di controllo sviluppato tumori rispetto a solo 3 delle 8 AMG102 topi trattati (Figura 4).
Figura 1: Immagine (A) mostra vite intracranica guida posizionato in una zona situata direttamente al di sopra del nucleo caudato. Il ammanettato hamilton siringa (pre-caricato con le cellule) viene poi inserito all'interno della vite guida in modo che 2 mm di aghi si estende oltre la guida e le cellule vengono iniettate 3,5 millimetri all'interno del nucleo caudato. La siringa viene poi rimosso e sostituito da uno stiletto (B). Il dispositivo di infusione automatica (C) può iniettare fino a 10 animali alla volta. Qui sono cinque iniezioni simultanee (D).
Figura 2: Schema del protocollo di studio. Le cellule sono state iniettate al giorno 0 con il trattamento a partire dal giorno 4. Animali di controllo hanno ricevuto una iniezione di PBS (100 l) IP, mentre il gruppo di trattamento hanno ricevuto una iniezione di AMG102 (100 μg/100 microlitri) IP. Queste iniezioni sono state somministrate ogni secondo giorno per 10 giorni. Un totale di 6 iniezioni sono state eseguite. Gli animali sono poi stati monitorati per 70 giorni per eventuali segni di disturbi neurologici e fisici.
Figura 3: curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza confronto controllo e AMG102 topi trattati. Sopravvivenza significativo è stato ottenuto dopo trattamento con AMG102 (p = 0,005).
Figura 4: microfotografie di sezioni coronali del cervello dimostrando sviluppo di tumori negli animali di controllo (A) e non lo sviluppo del cervello tumore nel AMG102 animali trattati (B). Barra di scala è di 1 mm.
Discussion
Il metodo intracranica vite guida qui presentata consente la creazione rapida e riproducibile di xenotrapianti intracranica e nelle mani di un tecnico animale addestrato, questa procedura è eseguita molto facilmente senza la necessità di un dispositivo stereotassico. Il nostro metodo combina l'uso di una vite di guida, per individuare con precisione la regione del cervello più adatto per lo sviluppo del tumore in vivo, e una pompa per infusione automatizzata che permette l'inoculazione simultanea di un massimo di 10 animali alla volta. La vite procedura guida aumento richiede meno di 5 minuti per eseguire. L'infusione di cellule automatizzati a 30 microlitri / h richiede solo 10 minuti per un volume 5 microlitri. Questo assicura un dosaggio preciso ad un tasso costante e riduce il rischio di espulsione delle cellule nella zona extra-craniche a causa di aumento della pressione intracranica. Abbiamo anche eseguito questa procedura con 10 microlitri volumi e non hanno osservato alcun extra-craniche la crescita del tumore a causa di reflusso cellulare. Come la pompa di infusione automatica permette anche più animali per essere inoculati contemporaneamente siamo in grado di iniettare fino a 60 animali per ora rispetto ad una procedura stereotassica che è limitata a circa 15 animali ogni ora.
La fase più critica in questa procedura è la posizione della vite di guida nel cranio come la sua posizione determina la posizione finale della massa tumorale. Se la vite di guida è troppo centrale, le cellule verranno iniettate in una regione tra i due emisferi cerebrali, mentre se la guida è posto a in avanti, le cellule non sarà iniettato nel cervello a tutti. E 'quindi essenziale per essere il più precisi possibile nel trovare da 2,5 mm lateralmente guida e 1 mm anteriore al bregma 1. In questo studio abbiamo utilizzato una vite guida in acciaio, anche se le viti guida in plastica sono disponibili anche per quegli studi che necessitano di imaging cerebrale come la risonanza magnetica o PET 6. Anche se la pompa di infusione automatica è il costo proibitivo per alcuni gruppi, le cellule possono ancora essere iniettato manualmente in modo più rapido rispetto agli approcci stereotassica. In generale, questo metodo rapido, preciso e riproducibile può essere utilizzato per studiare glioma, il medulloblastoma e tumori del tronco cerebrale 7. Questa procedura è stata effettuata su oltre 500 topi tra i nostri due laboratori con i decessi dovuti a reazioni inaspettate anestetico (<1%). I topi che sono stati avvitata con la vite di guida e, successivamente, infuso con le cellule non sono morti o subito alcun complicazioni neurologiche come risultato della procedura. Gli animali sono sopravvissuti ultimi 100 giorni senza complicazioni. Anche se abbiamo preferito utilizzare un mouse senza peli, un immuno-compromessi topo con i capelli come le SCID sarebbe altrettanto appropriato fornito i capelli cranio è stato rimosso prima della chirurgia per mantenere il sito pulito e per evitare che i capelli interferire con vite di guida.
Ci sono nuove terapie diverse in fase di sviluppo per il trattamento dei gliomi 8-10. Recentemente abbiamo dimostrato che per via sottocutanea U87MG xenotrapianti glioma può essere inibita dal trattamento con AMG102 3; un anticorpo umanizzato diretto a HGF attualmente sottoposto a valutazione clinica negli glioma 5. Abbiamo usato il metodo descritto qui di stabilire i tumori intracranici U87MG nel cervello dei topi nudi. Il nostro studio mostra chiaramente l'utilità del metodo e dimostra che AMG102 inibisce significativamente la crescita di xenotrapianti U87MG ortotopico. Noi continueremo ad utilizzare questo modello per determinare quali altre terapie possono essere utilizzati in combinazione con AMG102 per ottenere inhibition più efficace della crescita tumorale.
Disclosures
Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca da Amgen Inc.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Verlene Henry e Lindsay Holmes per l'assistenza nello sviluppo di questo modello. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Fondazione S. James McDonnell (# 220020173).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
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