Summary
Protocol
NIH3T3 la préparation des cellules:
A. Cellules pour l'éjection
- Trypsiniser cellules, puis diluer 1:1 avec les médias de cellules, et le transfert à partir d'un flacon T75 à un tube Falcon de 15 ml
- Isoler les cellules en un culot par centrifugation, aspirer le surnageant et laver les cellules avec du DPBS
- Isoler les cellules en un culot à nouveau, et aspirer le surnageant
- Resuspendre les cellules dans les médias
- Déterminer la densité des cellules avec des hémocytomètre (~ 200 x 10 4 cellules / mL par flacon T75)
- Solution cellulaire Centrifuger, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans le montant approprié des médias pour différentes concentrations cellulaires
Cellule d'éjection B.
- Cellules Vortex avant de l'utiliser pour l'éjection
- Transférer 200 ul de solution de la cellule dans la seringue
- Réglez le mode approprié sur un générateur d'impulsions
- Pour éjecter des gouttelettes d'unique et de multiples gouttelettes (rafales), mis en générateur d'impulsions à «E. BUR" mode
- Pour l'éjection de gouttelettes en continu, mis en générateur d'impulsions à "NORM" mode
- Modifier les paramètres du signal
- Réglez le niveau de haute et basse tension de sortie niveau: HIL à 5 V et de LOL à 0 V et assurez-vous de la «LIM» est allumée
- Régler le signal comme un signal carré
- Changer la quantité de temps l'électrovanne est ouverte pour l'éjection de gouttelettes en changeant la valeur de "IFD" ou le changement cyclique («devoir»)
- Modifier la fréquence d'éjection en changeant la valeur de "PER"
- Modifier le nombre de gouttelettes éjectées dans un élan en changeant la valeur de "BUR"
- Solution cellulaire éjection sur le substrat préparé pour l'imagerie au microscope
Coloration C.
- Maquillage solution de colorant avec 0,5 uL calcéine-AM et 2 uL d'éthidium homodimère par ml de DPBS
- Plongez substrat préparé dans une solution de teinture
- Laisser l'échantillon à incuber pendant 10 minutes à 37 ° C avant d'imagerie
Validation Experiment
- Sur un Nikon Eclipse TE-2000 U microscope à fluorescence
- Logiciels avancés spot (Diagnostics, Inc)
- Live / Dead Assay
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
Trypsin | 0.05% solution | |||
NIH 3T3 cell medium | ||||
DPBS | Buffer | |||
T75 | Tissue culture flasks | |||
Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |