Summary
Protocol
NIH3T3 hücrelerinin hazırlanması:
Ejeksiyon için A. Hücreler
- Sonra da hücre, hücre medya ile seyreltilmiş 1:1, ve T75 balonuna 15 ml Falcon tüp transfer Trypsinize
- Santrifüj edilerek pelet hücreleri aşağı Spin süpernatant aspirat ve hücreleri DPBS ile yıkayın
- Pelet içine hücreleri tekrar aşağı çevirin ve süpernatant aspirat
- Medyada yeniden süspanse hücreleri
- Hemasitometre (~ 200 X 10 4 T75 şişesi başına hücre / ml) ile hücre yoğunluğunu
- Santrifüj hücre çözümü, supernatant aspirat, medya uygun miktarda ve değişik hücre konsantrasyonları için tekrar süspansiyon
B. Hücre ejeksiyon
- Çıkarılmaya kullanmadan önce Vortex hücreleri
- Enjektöre hücre çözümü 200 mcL transfer
- Darbe jeneratörü uygun modu ayarlama
- Çıkarırken, tek damlacıkları ve çoklu damlacıkları (patlamaları), "E. BUR" modunda darbe jeneratör
- Sürekli damlacık ejeksiyon için, "NORM" moduna darbe jeneratör
- Sinyali ayarları değiştirin
- 5 V ve LOL 0 V ve emin olun "LIM" LED HIL: yüksek seviye ve düşük seviye çıkış voltajı ayarla
- Sinyal kare dalga olarak ayarlayın
- Solenoid valf "WID" değerini değiştirerek veya görev döngüsü değişen açık damlacık ejeksiyon zaman miktarını değiştirme ("HİZMET")
- "BAŞINA" değerini değiştirerek ejeksiyon frekans değiştir
- "BUR" değerini değiştirerek bir patlama çıkarılır damlacıkların sayısını değiştirme
- Mikroskobu ile görüntüleme için hazırlanmış yüzey üzerine Çıkar hücre çözümü
C. Boyama
- 0.5 mcL Calcein-AM ve DPBS ml başına 2 mcL ethidium homodimer boya çözüm Makyaj
- Boya çözüm daldırın hazırlanan substrat
- İzin örnek 37 az 10 dakika süreyle inkübe ° C görüntüleme önce
Deney Doğrulama
- Nikon Eclipse TE-2000 U Floresan Mikroskobu
- Spot gelişmiş yazılım (Diagnostics, Inc.)
- Ölü / Canlı Testi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
Trypsin | 0.05% solution | |||
NIH 3T3 cell medium | ||||
DPBS | Buffer | |||
T75 | Tissue culture flasks | |||
Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |