Summary
Protocol
NIH3T3 cellule preparazione:
Le cellule A. espulsione
- Trypsinize cellule, poi diluire 1:1 con mezzi di comunicazione cellulare, e il trasferimento da un pallone T75 ad un tubo da 15 ml Falcon
- Spin le cellule in una pallina da centrifugazione, aspirare il surnatante e lavare le cellule con DPBS
- Spin le cellule in una pallina di nuovo e aspirare il surnatante
- Risospendere le cellule in mezzi di comunicazione
- Determinare la densità delle cellule con emocitometro (~ 200 x 10 4 cellule / ml per T75 fiasco)
- Cellula soluzione centrifuga, aspirare il surnatante e risospendere in giusta quantità di supporti per la variazione delle concentrazioni di cellule
B. cella di espulsione
- Cellule vortice prima di utilizzare per l'espulsione
- Trasferire 200 ul di soluzione di cella in siringa
- Impostare la modalità appropriata sul generatore di impulsi
- Per espellere gocce singole e multiple gocce (treni), insieme al generatore di impulsi "E. BUR" modalità
- Per l'espulsione delle gocce continuo, generatore di impulsi impostato in modalità "NORM"
- Modificare le impostazioni del segnale
- Impostare il livello alto e basso livello di tensione di uscita: HIL a 5 V e LOL a 0 V e assicurarsi che il "LIM" LED è acceso
- Impostare il segnale come un impulso quadrato
- Modificare la quantità di tempo la valvola solenoide è aperta per l'espulsione delle gocce, modificando il valore di "WID" o cambiando duty cycle ("dovere")
- Modificare la frequenza di espulsione, modificando il valore di "PER"
- Modificare il numero di goccioline espulse in uno scoppio, modificando il valore di "BUR"
- Cellula soluzione di espulsione su substrato preparato per l'imaging con microscopio
C. colorazione
- Portare soluzione colorante con 0,5 microlitri calceina-AM e 2 omodimero microlitri di etidio per ml di DPBS
- Immergere substrato preparato in soluzione colorante
- Lasciare campione ad incubare per 10 minuti a 37 ° C prima di imaging
Esperimento di convalida
- Su una Nikon Eclipse TE-2000 Microscopio U fluorescente
- Spot software avanzato (Diagnostics, Inc.)
- Live / Dead Assay
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
Trypsin | 0.05% solution | |||
NIH 3T3 cell medium | ||||
DPBS | Buffer | |||
T75 | Tissue culture flasks | |||
Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |