Summary
Protocol
NIH3T3 celler förberedelser:
A. celler för Utmatning
- Trypsinize celler, sedan späd 1:1 med cell-media, och överföring från en T75 kolven till en 15 ml Falcon rör
- Spinn ner celler till en pellet genom centrifugering, aspirera supernatanten och tvätta cellerna med DPBS
- Spinn ner celler till en pellet igen, och aspirera supernatanten
- Resuspendera cellerna i media
- Bestäm celltäthet med hemocytometer (~ 200 x 10 4 celler / ml per T75 kolv)
- Centrifugera cell lösning, aspirera supernatanten och återsuspendera i lämplig mängd av media för olika cell koncentrationer
B. Cell utmatning
- Vortex celler innan du använder för utmatning
- Överföring 200 mikroliter av cell-lösning i sprutan
- Ställ in lämpligt läge på pulsgenerator
- För mata ut enstaka droppar och flera droppar (spricker), som pulsgenerator till "E. BUR"-läge
- För kontinuerlig droppe utkast, som pulsgenerator till "NORM"-läge
- Ändra signalen inställningar
- Ställ hög nivå och låg nivå utspänning: HIL till 5 V och LOL till 0 V och se till att "LIM" LED är på
- Ställ in signalen som en fyrkantig puls
- Ändra tid magnetventilen är öppen för droppsmitta utskjutning genom att ändra värdet för "WID" eller ändra intermittens ("plikt")
- Ändra frekvensen för utkast genom att ändra värdet för "Per"
- Ändra antalet droppar utkastade i en explosion genom att ändra värdet för "BUR"
- Mata cell lösningen på förberett substrat för avbildning med mikroskop
C. Färgning
- Fyll färglösningen med 0,5 mikroliter kalcein-AM och 2 mikroliter Ethidium homodimer per mL DPBS
- Sänk förberett substrat i färglösningen
- Låt prov inkubera i 10 minuter vid 37 ° C innan bildbehandling
Experiment Validering
- På en Nikon Eclipse TE-2000 U fluorescerande mikroskop
- Spot avancerad programvara (Diagnostics, Inc.)
- Live / Dead-analys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
Trypsin | 0.05% solution | |||
NIH 3T3 cell medium | ||||
DPBS | Buffer | |||
T75 | Tissue culture flasks | |||
Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |