Summary
골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.
Abstract
microcontact 인쇄 직접 단백질, 2 DNA, 3 silanes, 4 자아의 형성을 포함하여 분자의 큰 번호를 인쇄하는 고용 수 있지만 Microcontact 인쇄. 잘 정의된 패턴 기판의 생성을위한 신속한 높은 재현성 방법을 제공 하나 - 조립 골드에 긴 사슬 alkane의 thiols에서 monolayers이 (샘스) 단백질 및 접착제와 강한 지역을 포함하는 특정 패턴을 셀 범위를 제한하는 간단한 방법을 제공합니다. 이 제한은 세포 형태를 제어하기 위해 사용되며 단백질과 세포 생물학 질문 다양한 조사하는 데 유용합니다 수 있습니다. 여기, 우리는 세포 연구를위한 잘 정의된 단백질 패턴 생성을위한 일반적인 방법을 설명하는 다섯이 프로세스는 세 단계 포함 :. 석판술를 사용하여 무늬 마스터의 생산을,의 PDMS 스탬프의 생성 및 microcontact 인쇄 골드 - 코팅 기판. 일단 패턴이 세포 배양 기판은 confining 단백질 및 / 또는 패턴 셀 (기본 셀 또는 셀 라인)의 수 있습니다.
자기 조립 monolayer 화학의 사용 패턴 단백질 / 세포 접착 지역이 아닌 지역에 접착제를 통해 정확한 컨트롤을 허용, 이것은 직접 단백질 스탬프를 사용하여 얻을 수 없습니다. Hexadecanethiol, microcontact 인쇄 단계에서 사용되는 긴 사슬 alkane의 thiol은 쉽게 솔루션에서 단백질을 adsorbs 소수성 표면을 생산하고 있습니다. 기판의 비 인쇄 영역을 backfilling에 사용되는 글리콜 - 종료 thiol는 단백질 흡착을 방지하고 성장 따라서 세포 monolayer를 만듭니다. 6이 thiol 단량체가 정확하게 지원하는 기판의 영역을 정의하는 고도로 구조화된 monolayers을 생산 단백질 흡착 및 세포 성장. 결과적으로,이 기판은 반도체 제작에 세포 행동 7 연구에서 응용 프로그램의 다양한 유용합니다. 8
monolayer 화학 다른 종류의가 직접 유리 기판에 패턴을 만들 수 trichlorosilanes를 사용하여 우리 그룹에서 작업을 포함하여 세포 배양 연구에 사용되고있는 반면, 금에 alkane thiols에서 형성 9 패턴 monolayers 준비를 스트레이트 - 앞으로하고 있습니다. 또한, monolayer 준비에 사용되는 단량체가 상업적으로 사용 가능한 안정하고, 저장 또는 불활성 분위기 하에서 처리를 요구하지 않습니다. alkane thiols의에서 준비 패턴 기판은 셀 감금을 유지, 여러 번 재활용하고 활용할 수 있습니다. 10
Protocol
1. 문양 마스터 (그림 1)의 준비
- 센터 실리콘 스핀 - coater에서 웨이퍼와 표 1에서 두 사이클 스핀 프로그램의 초기 단계에서 아세톤과 웨이퍼를 씻어. 아세톤은 깨끗하고 마른 웨이퍼를 떠나 스핀 프로그램의 두 번째 단계에서 증발합니다.
- 약 1 ML을 적용 AZ9245 표 1에서 설명한 조건을 사용하여 웨이퍼 및 스핀 - 코팅에 포토 레지스트 / 년 (직경).
- 소프트 - 베이크 110 포토 레지스트 코팅 웨이퍼 ° 높은 균일도의 열판을 사용하여 2m를위한 C.
- Photopattern 중 직접 쓰기 석판술 시스템 또는 마스크 aligner 시스템과 적절한 마스크를 사용하여 기판. 마스크는 상업 소스의 숫자에서 구입하실 수 있습니다. 또한, 광학 평면에 매달 자외선 흡수제 잉크, 함께 인쇄된 투명는 큰 기능으로 패턴을 제작하는 데 사용할 수 있습니다.
- 부드러운 교반과 1m 45 S에 대한 반도체 등급 탈이온수 : 1시 2분 400K 개발자의 패턴 웨이퍼를 개발. 반도체 등급 탈이온수 및 질소의 흐름 (N 2) 가스로 건조와 철저히 씻어. 패턴 개발은 UV 필터와 현미경을 사용하여 확인하실 수 있습니다. 패턴이 완전히 발달되지 않은 경우, 웨이퍼는 추가 시간에 개발 솔루션에 제공될 수 있습니다.
참고 : 최상의 결과를 얻으려면, photopatterning는 청정실 환경에서 수행되어야합니다.
2. PDMS 스탬프의 작성 (그림 2)
- 무게 수지에 의해 10시 1분 준비 : Sylgard 182 (PDMS)의 경화제의 혼합물과 완전히 일회용 배양 접시에있는 혼합물로 마스터 (photopatterned 웨이퍼) 커버.
- 데 - 가스 PDMS - 덮인 더 거품이 표시되지 않습니다과 스탬프가 1.5 H. 65 ° C에서 오븐에 치료하도록 때까지 진공 dessicator의 마스터 이전 치료, 그것은 드 가싱 단계에서 수면 위로 떠오르 수 있으므로 마스터가 접시의 맨 아래에 있는지 확인하십시오 중요합니다.
- 마스터의 진압 PDMS를 잘라 적당한 크기로 잘라. 먼지와 파편으로부터 보호하기 위해 대상 컨테이너 (최대 기능 측면)에 우표를 보관합니다.
3. 문양 골드 기판의 준비 (그림 3)
- 아무 25mm를 준비하지 않습니다. 10 M.에 대한 산소 플라즈마와 함께 그들을 치료하여 금속 증착 1 라운드 유리 coverslips 각 단계 사이에 N 2 가스의 흐름과 함께 건조, 두 에탄올과 함께 다음 18.2 MΩ 탈이온수로 두 번 씻어.
- 멀티 포켓 전자 - 빔 증착 시스템을 이용하여 예금 50 티타늄은 150 골드가옵니다. 티타늄 레이어와 황금 층의 증착 사이의 증발기를 환기하지 마십시오. 또는, 골드 코팅 coverslips가 공급 업체의 다양한 구입하실 수 있습니다, 그러나, 그것은 금속 층이 전자 - 빔 증발 및 열하지 증발 준비하는 것이 중요합니다. 사용하기 전에 11 : 외부 소스에서 구입한 경우, 골드 기판은 플라즈마 산화 또는 "피라 냐는 물고 기지 너한테 '(30 % H 2 O 2. 7시 3분 콩크 H 2 SO 4)으로 세척 수 있습니다.
참고 : "피라 냐가"솔루션은 유기 화합물의 존재에 폭발합니다.
- 스탬핑 솔루션 절대 에탄올 10 MM의 hexadecanethiol 및 backfilling 솔루션 절대 에탄올 1 MM 글리콜 - 종료 thiol를 준비합니다.
- 에탄올과 우표를 씻어 N 2 가스로 완전히 건조. 완전 코팅까지 PDMS 스탬프 dropwise 솔루션을 스탬프 적용합니다. N 2 가스 철저 우표를 건조시킵니다. PDMS 스탬프의 기능에 따라 적절하게 5A 또는 5B로 진행합니다.
- 부드럽게 골드 기판에 도장을 눌러 monolayer가 15 양식 수 있도록 S.
- 기판이 변할 수 있습니다 확보, 18.2 MΩ 탈이온수가 포함된 배양 접시에 골드 기판를 놓습니다. 부드럽게 골드 기판에 도장을 눌러 monolayer가 15 양식 수 있도록 S.
- 각 씻어 배양 접시에있는 기판을 배치 후 N 2 가스로 건조, 에탄올과 함께 두 번 스탬프 기판 린스.
- 솔루션을 backfilling와 기판을 커버하고 증발을 방지하기 위해 parafilm으로 요리를 밀봉.
- 배경 monolayer가 12-14 H. 동안 짙은 어둠 속에서 형성하도록 허용
- backfilling 솔루션에서 패턴 coverslip을 제거하고 각 린스 후 N 2 가스로 건조, 에탄올로 두 번 씻어.
4. 문양의 기판에 단백질과 세포를 적용
- 500 μL 1 Dulbecco의 인산의 ML과 작은 페트리 접시 또는 세포 배양 챔버와 덮개의 패턴 coverslip을 장소 (DPBS) 살린 버퍼. DPBS 완전히에도 단백질 범위를 보장하기 위해 단백질 보육 동안 기판을 커버해야합니다.
- DPBS에 단백질의 집중 솔루션을 추가하고 파이프로 솔루션을 혼합팅 여러 번. 37 기판과 단백질 혼합물을 품어 ° C 1 H. laminin과 fibronectin에 대한 최종 농도는 일반적으로 각각 12 μg / ML 20 μg / ML입니다. 단백질은 쉽게 패턴 시각화 수 있도록 아민 반응 형광 염료로 분류하실 수 있습니다. 그러나, 라벨 단백질은 단백질 라벨로 레이블이 지정되지 않은 단백질과 1시 1분은 생물 학적 활동에 영향을 줄 수 있습니다 혼합해야합니다.
- 부화 후, 기판을 건조하거나 공기 물 인터페이스를 통해 그것을 가지고하지를 돌보는 언바운드 단백질을 제거하는 DPBS (4 배)를 철저하게 기판 린스. 처음 세 rinses 후, 젖은 기판을 유지하기 위해 전체 세포 성장 매체의 약 500 μL를 추가합니다.
- 새로운 미디어와 기판을 씻어하는 데 사용되는 성장 미디어를 교체합니다.
- 교제를 끊다 및 기판에 도금을위한 세포를 계산합니다. 등 등 CHO - K1 세포로 hippocampal 뉴런 또는 불후의 세포 라인 등 어느 dissociated 기본 세포는, 이용하실 수 있습니다.
- 기판에 플레이트 dissociated 세포. 일반적으로 30-200 세포 / mm 2 사용됩니다.
5. 대표 결과 :
그림 1. 무늬 마스터의 photolithographic 준비 일반 설계도. 이 과정에서 실리콘 웨이퍼는 아세톤과 함께 세척 관심의 패턴에 노출 포토 레지스트와 코팅, 그리고 패턴이 개발되고 있습니다.
그림 2. PDMS 스탬프 준비를위한 일반적인 설계도. 이 과정에서 패턴 마스터가 Sylgard (10시 1분 수지 : 경화제)로 덮여, 60 오븐에 치료 진공 건조기, ° C에서 드 기름과 크기로 절단.
그림 3. 기판 patterning 일반 설계도. 이 과정에서 유리 기판은 전자빔 글리콜 종료 alkane의 thiols와 backfilled PDMS 스탬프를 사용하여 microcontact 인쇄 hexadecanethiol에 의해 패턴 증발기,, 그리고 찬란 - 표시된 단백질로 코팅을 사용하여 티타늄 (50A)과 골드 (150A)로 코팅하고 있습니다.
그림 4. 문양 마스터 (A)와 PDMS 스탬프 (B) 설명 방법을 사용하여 준비 하였다. 스케일 바는 100μm 있습니다.
그림 5. 패턴 샘스 AlexaFluor 647 - 라벨 fibronectin (A) 및 CHO - K1 세포 감금 (B)와 시각. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다.
그림 6. 체외에서 4 일 동안 마우스 E18 hippocampal 뉴런과 문양의 laminin 씨앗. AlexaFluor 350 복합 백신 laminin 항체는 패턴 시각화 (A)을 위해 사용되며 마우스 E18 hippocampal 뉴런은 MitoTracker 레드 580 (B) 물들일 수 있습니다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다.
그림 7. 패턴 기판 준비 잠재적인 함정이 AlexaFluor fibronectin 흡착 647 - 복합하여 시각. 고르지 단백질 흡착에 (A) 부족 혼합 연결됩니다. 부분 패튼 전송 리드를 스탬프 동안의 압력 (B) 유네븐 응용 프로그램입니다. 스탬핑하는 동안 (C) 과도한 압력이 붕괴를 스탬프로 이어질 수 있습니다. (D) rinsing 동안 공기 물 인터페이스 패턴 표면의 노출은 배경 단백질 흡착이 발생할 수 있습니다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다.
그림 8. 빠져들 patterning 공기에서 종래의 microcontact 인쇄로 인쇄하기가 어렵습니다 작은 기능과 패턴을 생성할 수 있습니다. 이미지 (A)와 (B) 공기 같은 PDMS 스탬프 (A) 또는 탈이온수 (B)로 인쇄 같은 패턴의 다른 지역을 보여줍니다. 패턴을 (스탬프 붕괴를 방지하기 위해 추가) 서라운드 10μm 전체 지원 라인 (A), 그러나로 표시된 작은 도트 기능 (B) 볼 수없는 모습입니다. 이것은 공기에 인쇄가 큰 기능 잘 작동하지만, 물속에 인쇄 기능이있는 작은 패턴 필요할 수 있습니다 보여줍니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다.
| 주기 | 가속 속도 (RPM / S) | 최종 속도 (RPM) | 시간 (s) |
| 1 | 500 | 1000 | 5 |
| 2 | 3800 | 3800 | 30 |
표 1.투 - 사이클 스핀 프로그램은 실리콘 웨이퍼에 AZ9245의 4.5 μm의 두꺼운 코팅을 만드는 데 사용.
패턴 기판, 포토 레지스트의 마스터의 형성을위한 PDMS 스탬프를 준비하려면 것은 첫 번째 (그림 1 및 4A) 가공입니다. 주인은 우표의 역수이며 중 직접 쓰기 리소그래피 시스템 또는 마스크 aligner를 사용하여 만들어집니다. 같은 AZ9245 같은 긍정적인 포토 레지스트는, 마스터 생산에 사용되는 경우, 저항 - 코팅 웨이퍼는 최종 기판에 나타납니다 동일한 패턴으로 빛에 노출됩니다. 항상 가능하지 않다지만, 그것은 PDMS 스탬프 마스터를위한 이상적인 비율 (두께에 저항하는 기능 크기) 1시 2분 것을보고되었습니다. 13 우리는 자연에 따라 1시 40분의 가로 세로 비율이 가능하다는 사실을 발견했습니다 패턴. 조건 하에서 AZ9245 코팅된 실리콘 웨이퍼 4.5 μm의의 호칭 두께와 포토 레지스트를 제공 여기에서 설명한. 우리는 AZ9245의 두께가에서> 100 μm의 2 μm의에 이르기까지 다양한 기능을 PDMS 마스터를 생산하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.
PDMS 스탬프는 포토 레지스트 (그림 2)에서 조작 마스터를 사용하여 Sylgard 182 (또는 Sylgard 184)에서 주조하고 있습니다. 포토 레지스트 마스터는 동일한 스탬프의 여러 복사본을 만들려면 여러 번 사용할 수 있습니다. 경화 PDMS 후, 우표은 면도날과 결과 스탬프가 유리 coverslip (그림 4B)에 우표 기능 측면을 배치하여 현미경 시각 수를 사용하여 마스터에서 제거됩니다
찬란 표시된 단백질 (그림 3과 5)의 응용 프로그램에 의해 시각 수있는 날카로운, 명확한 단백질 패턴에 적절한 스탬핑 결과. 또는, immunohistochemistry는 셀 고정 후 단백질 패턴 (그림 6)을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 성장이 잘 불후의 세포 라인과 기본 셀 (그림 5, 6) 모두에 대한 단백질 패턴에 국한됩니다.
이 기술은 쉽게 마스터 있지만, 몇 가지 일반적인 문제가 발생할 수 있습니다. DPBS에 집중 단백질 솔루션의 충분한 혼합하지 않고 단백질의 응용 프로그램이 고르지 단백질 패턴 (그림 7A)을 초래할 수 있습니다. 부적 절한 스탬핑 부분 패턴 전송 또는 도장의 붕괴 (그림 7B - C)을 초래할 수 있습니다. 또한, 공기 adsorbed 단백질을 포함하는 배경으로 감소 저항 (그림 7D)을 일으키는 monolayer를 중단 수있는 패턴 기판을 알아가는 겁니다. 매우 작은 기능 (<5 μm의)와 높은 가로 세로 비율로 구성된 패턴은 종종 변할 microcontact 인쇄의 사용을 필요로합니다. 이 프로 시저 (3.5b) 물 (그림 8) 패턴 이외의 기판에 입금 hexadecanethiol 방지하는 장벽으로 사용됩니다. 14
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Discussion
문제 번호는 PDMS 스탬프 제작에 사용되는 마스터의 리소그래피 생산에 발생할 수 있습니다. 헤이지와 이것은 패턴과 확대하거나 누락된 기능에 저항 - 코팅 웨이퍼 결과의 노출 과도에 저항 - 코팅 웨이퍼 결과의 노출 부족. 작은 기능으로 주인이 photopatterning 및 개발 매개 변수의 광범위한 최적화 (포토 레지스트 제조 업체에서 권장하는 매개 변수를 넘어) 요구 수 있지만 일반적으로, 큰 기능 크기 (> 10 μm의)와 마스터는, 패턴에 상대적으로 쉽게하고 개발합니다. 생산 가장 어려운 주인은 크고 작은 기능이 모두 결합되어 있습니다.
마스터에서 PDMS 스탬프의 제작은 제 2에 설명된 절차를 사용하여 간단합니다. 그러나, 완전히 Sylgard 182의 두 가지 구성 요소를 섞어주의 이동합니다. 구성 요소의 완전한 혼합을 달성하지 않으면 강화 우표와 마스터의 가능성 파괴하는 무능력하게됩니다. 과잉 무력 사용 또는 복잡하게가 별거하는 동안 발생하는 경우 PDMS 스탬프에서 분리하면 또한 주인이 깨지는 수도 있습니다. 주인이 우표를 제거하는 과정에서 휴식 않으면, 그것은 여전히 에탄올로 세척 후 도장을 사용할 수 있습니다. 그러나,이 도장 결함 사이트와 패턴을 생산할 수 있습니다.
PDMS 스탬프를 이용하여 샘스의 microcontact 인쇄는 다목적이며 많은 응용 프로그램에 유용할 수 있지만, 중요한 단계의 번호가 성공적으로 단백질과 세포 제한을 달성하기 따라야합니다. 열 증발은 적절한 monolayer 형성을 지원하지 않는 거친 금 표면에 이르게 이후 좋은 단백질과 세포 제한을 얻으려면 금 기판은 전자 - 빔 증착에 의해 준비되어야합니다. 또한, 우리는 어떻게 유리 기판은 또한 황금 기판 및 monolayer 안정성의 품질에 영향을 티타늄과 금색 증착을위한 준비 것으로 나타났습니다. 유리 기판은 플라즈마 산화에 의해 준비 우리 손에 끓고 메탄올, "피라 냐는 물고 기지 너한테", 11 "독수리"솔루션, 12 다른 방법을 사용하여 청소 coverslips 훨씬 뛰어난 coverslips 포함한 기술의 다양한 사용하여 증착을위한 청소 수 있지만. 우리는 용매, 산, 그리고베이스 기반의 청소 방법을 감소 시간적 안정성 및 결함 사이트의 증가 숫자 monolayers 줄 것을 관찰했습니다.
최적의 단백질과 세포 패턴을 생산하는 데 필요한 정확한 스탬프 기술은 스탬프로 기능과 스탬프의 비율의 크기와 모양에 따라 다릅니다. 일반적으로 각각의 새 우표에 대한 정확한 스탬핑 기법은 최적화 및 스탬핑 기술은 여러 가지 시련 후에 개선되어야합니다. 스탬핑하는 동안 너무 많은 압력을 적용하는 것은 큰 가로 세로 비율 (그림 7C)이있는 우표와 함께 발생하는 경향이 있습니다 붕괴를, 스탬프를 가져올 것입니다. 또는 부분 패턴 전송 (그림 7B)에 너무 작은 압력 결과를 적용. 그것은 약간 패턴의 기능을 변경할 수 스탬프 기법을 활용하는 것도 가능합니다. 예를 들어, 우리는 기능이 약간 특정 기능의 크기가 변할 microcontact 인쇄 기술을 사용하여 줄일 수 있다고보고있다. 15 종종 공기 방울이 스탬프를 아래에 스민되는 시간과 다른 사람의 긴 기간 동안 단면의 크기 증가시킬 수있는 것을 발견 할 때 서브 머 지드 스탬핑을 수행하는 것은, 그러나,이 기술은 대형 가로 세로 비율과 함께 작은 기능을 원하는 수있는 최상의 결과를 제공할 수 있습니다.
자기 조립 monolayer 화학 함께 microcontact 인쇄를 사용하는 많은 장점이 있습니다. 직접 기판에 단백질을 인쇄할 때, conformational 변화는 단백질이 스탬핑 과정에서 건조하는 단계의 귀책 16 발생 표시되었습니다. 이 건조 단계는 차례로 단백질 기능에 영향을 미치는 단백질 집합과 변성에 이어질 것으로 생각됩니다. SAM 시스템에서 기판은 일반적으로 세포 배양을 위해 준비하는 방법과 동일한 버퍼 수성 솔루션에서 기판에 단백질의 adsorb. 또한, 단백질의 microcontact 인쇄는 단백질 모성 배경 분자의 부족으로 인해 오랜 기간에 대한 셀 감금을 달성하지 않습니다. 17 반대로, 글리콜 배경 monolayer의 사용 우수 감금을 위해 제공하고 있습니다. 5 경우에는 어디에 사용 금 기판 중 하나를 유치 여부 바람직하지 아니라, trichlorosilane 단량체가 단백질과 세포 제한 수 있도록 대신 활용할 수 있습니다. 9 단백질과 microcontact 인쇄에 의존하지 세포의 구속에 대한 방법이 있지만,이 방법 경향 보다 집중적인 노동과 동일한 기판의 다수를 생산 의무가 없습니다 일반적으로 생물 학적 연구를 위해 필요합니다. 18,19
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 누구의 집단 지식이 프로토콜을 가능하게했다 워싱턴 대학에서 전체 모러 그룹을 인정하고 싶습니다. 이 작품에 대한 자금은 정신 건강의 국립 연구소 (1R01MH085495)에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science, Inc. | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR international | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium piecesKamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR international | 52858-000 | |
| DPBS | VWR international | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR international | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
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