Summary
金长链烷烃硫醇形成的自组装单层膜（SAMS）提供了定义良好的蛋白质模式的形成和细胞禁闭基板。使用一个邮票回填与聚二甲基硅氧烷（PDMS）微接触印刷hexadecanethiol乙二醇终止烷烃硫醇单体生产蛋白质和细胞吸附加盖hexadecanethiol地区唯一的模式。
Abstract
微接触印刷提供了一个快速，为创建良好定义的图案衬底的高度重复性的方法1虽然微接触印刷，可直接打印大量的分子，包括蛋白质，DNA的 2，3和硅烷，形成自我金长链烷烃硫醇组装单层膜（SAMS）提供了一个简单的方法来限制蛋白质和细胞含有粘合剂和耐地区的具体模式。这禁闭可用于控制细胞的形态，是用于研究的蛋白质和细胞生物学的各种问题。在这里，我们描述了细胞研究创造良好定义的蛋白质模式的一般方法，5这个过程包括三个步骤：一个图案主生产采用光刻，创造一个PDMS邮票，和微接触印刷金涂基材。图案后，这些细胞培养基质围蛋白质和/或细胞（原代细胞或细胞株）的格局。
对图案的蛋白质/细胞粘附地区和非粘性地区的精确控制允许使用的自组装单层化学，不能使用直接的蛋白质冲压实现。 Hexadecanethiol，微接触印刷步骤所用的长链烷烃硫醇，产生一个疏水表面容易吸附溶液中的蛋白质。乙二醇终止的巯基，用于回填基板的非打印区域，创建一个单层抗蛋白质吸附，因此，细胞的生长。6这些巯基的单体生产的高度结构化膜，精确地界定地区的基板，可以支持蛋白质吸附和细胞的生长。因此，这些承印物是有用的各种广泛的应用，从7间行为研究创造微电子8。
虽然已用于细胞培养的研究，包括从本集团的工作，创建模式，直接在玻璃基板上使用trichlorosilanes的其他类型的单层化学，9图案形成单分子膜对黄金的烷烃硫醇直截了当的准备。此外，单层准备使用的单体商业，稳定，不需要储存或处理惰性气氛下。烷烃硫醇准备的图案基板也可以被回收和重复使用多次，维持细胞禁闭10。
Protocol
1。制备的图案硕士（图1）
- 中心硅片上的自旋涂布在两个周期自旋方案的表1中的最初步骤，并用丙酮冲洗晶圆。丙酮蒸发过程中的自旋留下一个清洁，干燥的晶圆计划的第二步。
- 应用约1毫升AZ9245光阻/（直径）晶圆和自旋大衣，使用表1中所述的条件。
- 软烤的光致抗蚀剂涂层的晶圆在110 ° C为2米，用高均匀烤盘。
- Photopattern基材，使用一个直写光刻系统或光刻系统和适当的口罩。可以从商业来源购买口罩。此外，紫外线吸收剂，油墨贴光学平面，印刷的透明胶片，可用于生产与大的特点模式。
- 在1:2 400K开发商开发图形晶片：1米45的小号轻轻摇动半导体级去离子水。彻底冲洗半导体级去离子水和干燥的氮（N 2）气体的流。具有紫外线过滤器使用显微镜可以检查发展格局。如果模式没有完全开发，晶圆可以返回到有更多的时间发展的解决方案。
注：为了达到最佳效果，photopatterning应在洁净室环境。
2。制备PDMS的邮票（图2）
- 准备10:1的重量树脂：固化剂混合Sylgard 182（PDMS）和完全覆盖主一次性培养皿中的混合物（photopatterned晶圆）。
- 德气体的PDMS覆盖在真空dessicator中的主，直到无气泡是可见的，允许邮票治愈在65 ° C烘箱中为1.5小时。固化之前，重要的是确保主盘底部是在脱气的一步，因为它可能上升到表面。
- 削减的PDMS邮票主，修剪到合适的大小。储存在有盖容器（功能的一面朝上），以防止灰尘和杂物它图章。
3。图案的金基底的制备（图3）
- 没有准备25毫米。 1金属沉积与氧等离子体处理10米的圆形盖玻片18.2MΩ的去离子水其次是用乙醇的两倍，每一步之间的 N 2气体流与干燥，冲洗两次。
- 使用钛存款50多口袋里的电子束沉积系统，其次是150金。不泄的蒸发器之间的钛层和金层沉积。另外，镀金盖玻片可以从各种不同的供应商购买，但是，它是重要的金属层是由电子束蒸发和不热蒸发的准备。如果从外部购买，黄金基板可能由等离子体氧化或“食人鱼”（7:3浓H 2 SO 4：30％的H 2 O 2）11，在使用前进行清洗。
注：“食人鱼”的解决方案是在有机化合物的存在爆炸性。
- 准备冲压解决方案，在无水乙醇10毫米hexadecanethiol，和回填的解决方案，1毫米乙二醇终止无水乙醇巯基。
- 邮票用乙醇冲洗，并彻底干燥与 N 2气体。应用冲压解决方案，直到完全包覆的PDMS邮票滴加。与N 2气体彻底干燥的邮票。适当的PDMS邮票的特点的基础上，继续5A或5B。
- 轻轻按下的金基底上的邮票，并允许单层，形成15条
- 放入培养皿含有18.2MΩ去离子水菜金基底，确保基材被淹没。轻轻按下的金基底上的邮票，并允许单层，形成15条
- 用乙醇冲洗两次加盖基板，与N 2气体干燥后，每冲洗，并放置在培养皿基板。
- 回填解决方案覆盖的基板和菜用封口膜密封，以防止水分蒸发。
- 12-14小时，允许单层的背景，在黑暗中形成
- 回填解决方案中删除的图案盖玻片，并用乙醇冲洗两次，每冲洗后干燥与 N 2气体。
4。应用蛋白质和细胞图案的基材
- 广场图案中的一个小培养皿或细胞培养室和盖盖玻片，用500μl1毫升贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）。 DPBS必须完全覆盖在蛋白质孵化基材，以确保蛋白质覆盖。
- 添加蛋白浓缩液的DPBS和管道的混合解决方案婷若干倍。孵育与基体蛋白混合物，在37 ° C为1小时层粘连蛋白和纤维连接蛋白终浓度一般为12μg/ mL和20微克/ ml，分别。蛋白质可与胺反应的荧光染料标记，以便容易格局可视化。然而，标记的蛋白质混合1:1蛋白标记的未标记的蛋白质可干扰生物活性。
- 孵育后，用DPBS（4 - 5倍）彻底冲洗基板去除未结合的蛋白质，照顾，不会干的基板，或把它通过空气 - 水界面的。经过前三个漂洗，加入约500μL完整的细胞生长介质，以保持湿基材。
- 更换的增长，用于冲洗与新媒体的基板媒体。
- 分离和计数细胞电镀基板上。无论是分离的主细胞，如海马神经元，或永生细胞株，如CHO - K1细胞，可以利用。
- 板基板上分离的细胞。通常使用30至200个细胞/毫米2。
5。代表性的成果：
图1。一个图案主光刻准备的一般原理图。在这个过程中，用丙酮清洗硅片，涂光致抗蚀剂，接触到的利益格局，和开发模式。
图2。PDMS的邮票准备示意图。在这个过程中，图案的主人是覆盖Sylgard（10:1树脂：固化剂），毒气在一个真空干燥器烘箱中固化，在60 ° C，并切割成一定的尺寸。
图3。基板图案的一般原理图。在这个过程中，玻璃基板上涂有钛（50A）和黄金（150A），利用电子束蒸发器，微接触印刷hexadecanethiol使用的PDMS邮票图案，与乙二醇终止的烷烃硫醇回填，并涂有荧光标记的蛋白质。
图4主图案（A）和PDMS的邮票（二）使用描述的方法制备。比例尺是100微米。
图5。图案地空导弹AlexaFluor 647标记纤维连接蛋白（A）和CHO - K1细胞禁闭（二）可视化。比例尺是100微米。
图6。图案层粘连蛋白与E18小鼠海马神经元在4天的体外种子。 AlexaFluor 350标记的抗层粘连蛋白抗体用于模式的可视化（一）和E18小鼠海马神经元MitoTracker红580（二）染色。比例尺是100微米。
图7。AlexaFluor 647 -共轭纤维连接蛋白吸附可视图案基材的准备潜在的隐患。 （一）不足，不平衡的蛋白质吸附的混合信息。 （二）应用的压力不平衡，在冲压导致部分彭定康转移过程中。 （三）在冲压过程中过度的压力可能会导致邮票崩溃。 （四）暴露到空气中的水界面图案的表面，在漂洗，可以在背景中蛋白质的吸附结果。比例尺是100微米。
图8。埋弧焊图案可以产生小的特点，很难在空气中的传统的微接触印刷打印模式。图像（a）和（b）显示不同地区的相同的图案，印有相同的PDMS邮票（一）在空气中或去离子水（二）。 10μm的广泛支持线环绕的模式（添加，以帮助防止邮票崩溃）（一），然而，（二）的小圆点所示的功能都没有见过。这表明，在空气中的印刷作品以及较大的特点，但在水中的印刷可能会需要较小的特点，模式。比例尺是20微米。
| 周期 | 加速率（转/秒） | 最终速度（RPM） | 时间（s） |
| 1 | 500 | 1000 | 5 |
| 2 | 3800 | 3800 | 30 |
表1。双周期自旋方案，用于创建一个4.5微米厚涂在硅片上的AZ9245。
要准备PDMS的邮票的图案衬底，在光致抗蚀剂的主形成首先是捏造（图1，图4A）。法师是逆邮票和创建使用无论是直写光刻系统或光刻。当积极的光致抗蚀剂，如AZ9245，主生产使用，抵制涂层的晶圆被暴露在光线下具有相同的图案将出现在最后的基板。虽然它并不总是可行的的，它已经报道（特征尺寸抵制厚度）的PDMS邮票的主人是理想的长宽比为 1:2 13。我们发现，1:40的长宽比是可能的，根据性质的格局。这里描述的给予与标称厚度为4.5微米的光致抗蚀剂AZ9245的条件下，涂硅晶片。我们发现，这AZ9245厚度可以被用来生产PDMS的主人，从100微米到2微米的功能不等。
PDMS的邮票是从Sylgard 182（或Sylgard 184）使用光致抗蚀剂（图2）捏造主投。光致抗蚀剂的主人，可多次使用相同的邮票，以创建多个副本。硬化后的PDMS，邮票从主机使用刀片和由此产生的邮票可在显微镜下可视化邮票功能的一面朝下放置在一个玻璃盖玻片（图4B）
适当的冲压结果在一个锐利，清晰的蛋白质的模式，应用荧光标记的蛋白（图3和图5），可以通过可视化。另外，免疫组化可用于可视化后，细胞固定的蛋白质模式（图6）。细胞生长局限于为永生细胞株和原代细胞（图5和6）的蛋白质模式。
虽然这种技术很容易掌握，几种常见的可能会出现问题。没有足够的应用程序在DPBS浓缩蛋白质溶液混合的蛋白质可导致不平衡蛋白质模式（图7a）。冲压不当可导致局部图案转移或邮票崩溃（图7B - C）。此外，露出图案基板吸附蛋白含在空气中能破坏导致抵抗力下降的背景（图7D）单层。非常小的特征（<5微米）和高宽比组成的图案往往需要淹没微接触印刷的使用。在此过程中（3.5B）水是用来作为屏障，以防止外的格局基板上沉积（图8）hexadecanethiol 14。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
一个用于PDMS的邮票创造主的平版印刷生产中可能出现的一些问题。曝光不足，在若隐若现的模式和曝光过度放大或缺少的功能抵抗涂层的晶圆结果抵抗涂层的晶圆结果。在一般情况下，与大特征尺寸（> 10微米）的主人是相对容易的图案和开发，而较小的特点的主人可以要求广泛photopatterning和发展参数优化（超越光阻制造商推荐的参数）。最困难的主人，生产大型和小型的功能结合起来。
从主的PDMS邮票的制作非常简单，使用第2条所述的程序。然而，必须采取完全混合Sylgard 182的两个组成部分。未能实现完全的混合组件，将导致无法变硬的邮票和可能破坏主。此外，主机可能会碎裂分离的PDMS邮票时，如果多余的使用武力，或在分离过程中发生扭曲。如果在取消印花税的过程中，掌握并打破它可能仍然是可能的，用无水乙醇清洗后使用的邮票。然而，这套邮票可能会产生有缺陷的网站的模式。
虽然微接触印刷地空导弹使用的PDMS邮票是多才多艺的，可以在许多应用程序，必须遵循的一些关键步骤，以实现成功的蛋白和细胞禁闭。要获得良好的蛋白质和细胞禁闭，黄金基板必须准备通过电子束沉积，因为热蒸发导致不支持适当的成膜粗糙金表面。此外，我们发现，玻璃基板是如何准备钛和金沉积，也影响了黄金基板的质量和单层稳定。虽然玻璃基板，可以清除沉积使用多种技术，包括甲醇沸点，“食人鱼”，11日和掌握在我们手中“秃鹰”的解决方案，12盖玻片等离子体氧化远远优于使用其他方法清洁盖玻片。我们观察到，溶剂，酸，基地为基础的清洗方法与单层下降时间稳定性和缺陷位置的数量增加。
确切的烫印技术，需要以产生最佳的蛋白质和细胞形态变化的基础上加盖的功能和邮票的宽高比的大小和形状。通常情况下，必须为每个新邮票的确切冲压技术优化和烫印技术，经过多次试验改进。应用冲压过程中压力太大，会导致邮票的崩溃，这是容易发生含有较大的长宽比邮票（图7C）。此外，应用太少压力的结果，在局部图案转移（图7B）。它也有可能采取烫印技术的优势，稍微改变格局的特点。时举例来说，我们已经发现功能，可以将略有增加，为较长的时间和其他冲压报告说，某些功能的尺寸可以减少使用淹没的微接触印刷技术15。往往成为被困邮票下方的气泡大小执行淹没冲压，但是，这种技术可能会在与大长宽比时小的特点所需的最佳结果。
有许多优点，使用结合自组装单层膜化学微接触印刷。当直接印刷到承印物的蛋白质构象的变化已经证明，发生16的蛋白质是在冲压过程中的干燥步骤。这种干燥步骤被认为是导致蛋白质聚集和变性，这反过来又会影响蛋白质的功能。在SAM系统，蛋白质吸附到基材从一个缓冲水溶液中，相同的基板通常是细胞培养的准备如何。此外，微接触印刷的蛋白质没有实现时间过长，由于缺乏蛋白质抗背景分子细胞禁闭17相比之下，使用乙二醇的背景单层提供优秀监禁。 案件 5使用黄金基板是不可能或不可取的，三 氯氢硅单体可以利用，而不是允许蛋白质和细胞的监禁9虽然有限制，不依赖于微接触印刷的蛋白质和细胞的方法，这些方法往往是通常需要更多的劳动力密集，不适合生产大量相同的基板生物学研究。18,19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢华盛顿大学的集体知识，这个协议可能在整个毛雷尔组。这项工作的经费是由国家精神卫生研究所（1R01MH085495）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science, Inc. | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR international | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium piecesKamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR international | 52858-000 | |
| DPBS | VWR international | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR international | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
- Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication. Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).
- Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning. Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).
- Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A.
- Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication. J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).
- Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).
- Prime, K. L., Whitesides, G. M. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).
- Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration. Langmuir. , 17733-17738 (2010).
- Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).
- Yanker, D., Maurer, J. Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth. Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).
- Johnson, D., Maurer, J. Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture. Chemical Communications. , 520-522 (2011).
- Herne, T., Tarlov, M. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces. J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).
- Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon. J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).
- Johannes, M., Cole, D., Clark, R. Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography. Applied Physics Letters. , (2007).
- Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. Submerged microcontact printing (SμCP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps. Langmuir. , 12060-12063 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. , 2059-2067 (1997).
- Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing. Langmuir. , 5154-5158 (2005).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).
- Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C.
- Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light. Langmuir. , 9080-9088 (2004).
