Summary
Self-monterade monolager (SAMS) bildas från långa tioler kedja alkan på guld ger väldefinierade substrat för bildning av protein mönster och cell instängdhet. Microcontact utskrift av hexadecanethiol med hjälp av en Polydimetylsiloxan (PDMS) stämpel följt av återfyllning med en glykol-terminerad alkan tiol monomer producerar ett mönster där protein och celler adsorbera endast stämplade hexadecanethiol regionen.
Abstract
Microcontact utskrift ger snabb, mycket reproducerbar metod för att skapa väldefinierade mönstrade substrat. 1 Medan microcontact utskrift kan användas för att direkt skriva ut ett stort antal molekyler inklusive proteiner, 2 DNA, 3 och silaner, 4 bildandet av själv monterade monolager (SAMS) från långa tioler kedja alkan på guld är ett enkelt sätt att begränsa proteiner och celler till specifika mönster som innehåller lim och resistenta regioner. Denna instängdhet kan användas för att styra cellmorfologin och är användbart för att pröva en mängd olika frågor i protein och cellbiologi. Här beskriver vi en generell metod för att skapa väldefinierade protein mönster för cellulära studier 5 Denna process omfattar tre steg. Produktionen av en mönstrad mästare med fotolitografi, skapandet av ett PDMS stämpeln och microcontact tryckning av en guld- belagda substrat. När mönstrade dessa cellodling substrat kan begränsa proteiner och / eller celler (primär celler eller cellinjer) till mönstret.
Användningen av egna sammansatta cellslager kemi möjliggör exakt kontroll över de mönstrade protein / cell självhäftande regioner och icke-självhäftande regioner, vilket inte kan uppnås med direkta protein stämpling. Hexadecanethiol, den långa kedjan alkan tiol används i microcontact tryckningen producerar en hydrofob yta som lätt adsorberar protein från lösningen. Den glykol-terminerad tiol, som används för återfyllning icke-tryckta regioner i substratet, skapar en monolager som är resistent mot protein adsorption och därmed celltillväxt. 6 Dessa tiol monomerer producerar mycket strukturerade monolager att exakt definiera delar av substrat som kan stödja protein adsorption och celltillväxt. Som ett resultat av dessa substrat är användbara för en mängd olika applikationer från studier av intercellulära beteende 7 till skapandet av mikroelektronik. 8
Även andra typer av monolager kemi har använts för studier cellodling, inklusive arbete från vår grupp att använda triklorsilaner att skapa mönster direkt på glas substrat, 9 mönstrade monolager bildas från alkan tioler på guld är okomplicerade att förbereda sig. Dessutom monomerer används för cellslager beredning är kommersiellt tillgängliga, stabila, och inte kräver lagring eller hantering under inert atmosfär. Mönstrad substrat framställda av alkan tioler kan också återvinnas och återanvändas flera gånger, att upprätthålla cell förlossning. 10
Protocol
1. Beredning av Mönstrad Master (Figur 1)
- Centrera kiselskiva på spinn-bestrykare och skölj rånet med aceton under den inledande steg i två steg spin-program i tabell 1. Den aceton avdunstar under andra steget av spin programmet lämnar en ren och torr wafer.
- Applicera ca 1 ml AZ9245 fotoresist / i (i diameter) till rånet och spin-rock med de villkor som beskrivs i tabell 1.
- Soft-baka fotoresist belagda rånet vid 110 ° C i 2 m med en hög enhetlighet kokplatta.
- Photopattern underlaget med hjälp av antingen en direkt-skriv fotolitografi system eller en mask Aligner och lämpliga mask. Masker kan köpas från ett antal kommersiella källor. Dessutom kan OH-film skrivs ut med UV-absorberande bläck, tejpade till en optisk platt, användas för att producera mönster med stora funktioner.
- Utveckla mönstrade rånet i 01:02 400K Utvecklare: halvledare kvalitet avjoniserat vatten i 1 m 45 s under försiktig omrörning. Skölj noga med halvledare kvalitet avjoniserat vatten och torka med en ström av kväve (N 2) gas. Mönster utveckling kan kontrolleras med hjälp av ett mikroskop med ett UV-filter. Om mönstret inte är fullt utvecklad, kan rånet returneras till att utveckla lösningen för ytterligare tid.
Obs: För bästa resultat bör photopatterning utföras i ett renrum miljö.
2. Beredning av PDMS Stamp (figur 2)
- Förbered en 10:01 i vikt harts: härdare blandning av Sylgard 182 (PDMS) och helt täcka master (photopatterned wafer) med blandningen i en disponibel petriskål.
- De-gas i PDMS-täckt mästare i ett vakuum exsickator tills inga bubblor är synliga och låta stämpeln att bota i ugn vid 65 ° C under 1,5 h. Före härdning är det viktigt att se till befälhavaren är längst ner i skålen som den kan stiga upp till ytan under de-gasning steg.
- Skär PDMS stämpel av befälhavaren och trim till lämplig storlek. Förvara stämpel i en täckt behållare (feature uppåt) för att skydda den från damm och smuts.
3. Beredning av Mönstrad Gold Substrat (Figur 3)
- Förbered 25 mm nr. 1 runda glas täckglas för metall nedfall genom att behandla dem med syre plasma för 10 m. Skölj två gånger med 18,2 Mohm avjoniserat vatten följt av två gånger med etanol, torka med en ström av N 2-gas mellan varje steg.
- Med hjälp av en multi-ficka elektronstrålebehandlade nedfall, följt deponera 50 titan med 150 ett guld. Inte ventilera förångaren mellan nedfall av titan lagret och guld lager. Alternativt kan guld-belagd täckglasen köpas från flera olika leverantörer, är det dock viktigt att metallager förbereds av elektronstrålebehandlade avdunstning och inte termisk avdunstning. Om köps från en extern källa, kan guld substrat rengöras med plasma oxidation eller "Piraya" (07:03 Konc H 2 SO 4:. 30% H 2 O 2) 11 före användning.
Anmärkning: "Piraya" lösning är explosiv i närvaro av organiska föreningar.
- Förbered stämpling lösning, 10 mm hexadecanethiol i absolut etanol och återfyllning lösningen, 1 mm glykol-upp tiol i absolut etanol.
- Skölj stämpeln med etanol och torka noga med N 2 gas. Applicera stämpling lösning på PDMS stämpeln droppvis tills fullt belagda. Torka stämpeln ordentligt med N 2 gas. Gå vidare till 5a och 5b i förekommande fall baseras på funktioner i PDMS stämpeln.
- Tryck försiktigt stämpeln på guld substrat och låta cellslager att bilda i 15 s.
- Placera guldet substratet i en petriskål med 18,2 Mohm avjoniserat vatten, se till att underlaget är under vatten. Tryck försiktigt stämpeln på guld substrat och låta cellslager att bilda i 15 s.
- Skölj stämplade substrat två gånger med etanol, torkning med N 2-gas efter varje sköljning och placera substrat i en petriskål.
- Täck underlaget med återfyllningen lösning och försegla skålen med parafilm att förhindra avdunstning.
- Låt bakgrunden cellslager bildas i mörker i 12-14 h.
- Ta bort det mönstrade täckglaset från återfyllningen lösningen och skölj två gånger med etanol, torkning med N 2-gas efter varje sköljning.
4. Tillämpa Protein och celler till Mönstrade substrat
- Placera mönstrade täckglas i en liten petriskål eller cellodling kammare och täck med 500 mikroliter till 1 ml Dulbecco är Fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). Den DPBS måste helt täcker substratet under protein inkubation att säkerställa jämn protein täckning.
- Lägg till en koncentrerad lösning av protein till DPBS och blanda lösningen genom att röretting flera gånger. Inkubera proteinblandningens med substratet vid 37 ° C under 1 h. Slutkoncentrationer för laminin och fibronektin är typiskt 12 mikrogram / ml och 20 mikrogram / ml, respektive. Protein kan märkas med en amin reaktiv fluorescerande färg för att möjliggöra enkla mönster visualisering. Bör dock märkta proteinet blandas 1:1 med omärkta proteiner som protein märkning kan påverka biologisk aktivitet.
- Efter inkubation, skölj underlaget noggrant med DPBS (4-5x) för att avlägsna obundet protein, se till att inte torka underlaget eller ta det via luft-vatten-gränssnitt. Efter de första tre sköljningar, tillsätt ca 500 mikroliter av kompletta medier celltillväxt att upprätthålla en våt substrat.
- Byt tillväxten medier som används för att skölja underlaget med färska medier.
- Avstånd och räkna celler för plätering på underlaget. Antingen dissocierade galvaniska element, exempelvis hippocampus nervceller, eller förevigad cellinjer, såsom CHO-K1 celler kan utnyttjas.
- Tavla dissocierade celler på underlaget. Vanligtvis 30 till minst 200 celler / mm 2 används.
5. Representativa resultat:
Figur 1. Allmänna schema för fotolitografiska beredning av en mönstrad mästare. I denna process är en kiselskiva rengöras med aceton, belagda med fotoresist, som utsätts för mönstret av intresse, och mönstret utvecklas.
Figur 2. Allmänna schematiska för PDMS stämpel beredning. I denna process är det mönstrade mästare täckt med Sylgard (10:1 harts: härdare), avgasade i vakuumexsickator, härdad i ugn vid 60 ° C, och skära till.
Figur 3. Allmänna schematiska för substrat mönstring. I denna process är glas substrat belagda med titan (50a) och guld (150A) med hjälp av en elektronstråle förångare, mönstrad med microcontact utskrift hexadecanethiol med en PDMS stämpel, återfylls med glykol avslutas alkan tioler, och överdragna med fluorescerande-märkta proteinet.
Figur 4. Mönstrad mästare (A) och PDMS stämpel (B) upprättas enligt de beskrivna metoderna. Skala barer är 100μm.
Figur 5. Mönstrade SAMs visualiseras med AlexaFluor 647-märkt fibronektin (A) och CHO-K1 celler förlossningen (B). Skala barer är 100 ìm.
Figur 6. Mönstrade laminin ympats med E18 musen hippocampus nervceller vid 4 dagar in vitro. AlexaFluor 350-konjugerat anti-laminin antikropp används för mönster visualisering (A) och E18 mus hippocampus nervceller färgas med MitoTracker Red 580 (B). Skala barer är 100 ìm.
Figur 7. Potentiella fallgropar i mönstrat substratet visualiseras genom AlexaFluor 647-konjugerade fibronektin adsorption. (A) Otillräcklig blandning leder till ojämn protein adsorption. (B) Ojämn tillämpning av trycket vid stämpling leder till partiell Patten överlåtelsen. (C) Överdrivet tryck under stämpling kan leda till att stämpla kollaps. (D) Exponering av mönstrad yta till luft vatten gränssnittet under sköljning kan resultera i bakgrunden protein adsorption. Skala barer är 100 ìm.
Figur 8. Pulverbågsvetsning mönstring kan producera mönster med små funktioner som är svåra att skriva med konventionella microcontact skriver ut i luften. Bilder (A) och (B) visar olika regioner i samma mönster, tryckt med samma PDMS stämpel i luft (A) eller avjoniserat vatten (B). 10μm-brett stöd linjer som omger mönster (läggas för att förhindra att stämpla kollaps) ses i (A), men (B) den mindre punkten funktioner som visas i ses inte. Detta visar att skriva ut i luften fungerar bra för större funktioner, men skriver i vatten kan vara nödvändig för mönster med mindre funktioner. Skala barer är 20 mikrometer.
| Cykel | Accelerationen (rpm / s) | Sluthastighet (rpm) | Tid (s) |
| 1 | 500 | 1000 | 5 |
| 2 | 3800 | 3800 | 30 |
Tabell 1.Två-takts snurra programmet används för att skapa en 4,5 ìm tjock beläggning av AZ9245 på en kiselskiva.
För att förbereda PDMS frimärken för bildandet av mönstrade substrat, en mästare i fotoresist är först tillverkas (figur 1 och 4A). Befälhavaren är inversen Stämpeln och skapas med hjälp av antingen en direkt-skriv litografi system eller en mask Aligner. När en positiv fotoresist, som AZ9245, används för produktionsprogram är motstå-belagda kiselskivor utsätts för ljus med samma mönster som kommer att visas på den slutliga underlaget. Även om det inte alltid möjligt, har det rapporterats att den ideala proportioner (karaktäristisk storlek att motstå tjocklek) för PDMS stämpel Masters är 1:2. Vi har funnit att bildförhållanden på 1:40 är möjliga, beroende på typen 13 av mönstret. AZ9245 belagda kiselskivor enligt de villkor som beskrivs här ger fotoresist med en nominell tjocklek på 4,5 ìm. Vi har funnit att denna tjocklek AZ9245 kan användas för att producera PDMS mästare med funktioner som sträcker sig från> 100 ìm till 2 ìm.
PDMS frimärken är gjutna från Sylgard 182 (eller Sylgard 184) med hjälp av befälhavaren tillverkat av fotoresist (Figur 2). Fotoresist mästare kan användas flera gånger för att skapa många kopior av samma stämpel. Efter härdning av PDMS är frimärken bort från befälhavaren med ett rakblad och den resulterande stämpel kan visualiseras i mikroskop genom att placera sidan stämpel funktion nedåt på ett glas täckglas (Figur 4B)
Korrekt stämpling resulterar i en skarp, klar protein mönster som kan visualiseras genom användning av fluorescerande protein (figur 3 och 5). Alternativt kan immunohistokemi användas för att visualisera det protein mönstret efter cell fixering (Figur 6). Celltillväxt är väl begränsad till det protein mönster för både förevigat cellinjer och primära celler (figur 5 och 6).
Även om denna teknik är lätt att bemästra, kan flera gemensamma problem uppstår. Tillämpningen av protein utan tillräcklig blandning av koncentrerat protein lösningen i DPBS kan leda till ojämn protein mönster (Figur 7A). Felaktig stämpling kan leda till partiell mönster överföra eller stämpel kollaps (Figur 7B-C). Dessutom utsätta mönstrade substrat som innehåller adsorberat protein i luften kan störa cellslager orsakar minskade motståndet i bakgrunden (Figur 7D). Mönster består av mycket små funktioner (<5 mikrometer) och höga aspekt kräver ofta användning av nedsänkt microcontact utskrift. I detta förfarande (3.5b) vatten används som en barriär för att förhindra hexadecanethiol från insättning på underlaget utsidan av mönster (Figur 8). 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett antal frågor kan uppstå i den litografiska produktion av master som används för PDMS stämpel skapande. Underexponering av motstå-belagda wafer resulterar i disigt och otydligt mönster och överexponering av motstå-belagda wafer resulterar i större eller saknade funktioner. I allmänhet mästare med stora inslag storlekar (> 10 mikrometer) är relativt lätta att mönster och utvecklas, medan mästare med mindre funktioner kan kräva omfattande optimering av photopatterning och utveckling parametrar (utöver de parametrar som rekommenderas av fotoresist tillverkaren). Den svåraste mästarna att producera kombinera både stora och små funktioner.
Tillverkning av ett PDMS stämpel från en master är enkelt att använda det förfarande som beskrivs i avsnitt 2. Dock måste man för att helt blanda de två komponenterna i Sylgard 182. Underlåtenhet att uppnå fullständig blandning av komponenterna kommer att resultera i en oförmåga att härda stämpel och sannolika förstörelse av befälhavaren. Dessutom kan befälhavaren splittras när som avskiljer den från PDMS stämpeln om militärt övervåld används eller vrida inträffar under separation. Om befälhavaren bryter i processen för att ta bort stämpeln, kan det fortfarande vara möjligt att använda stämpeln efter rengöring med etanol. Dock får denna stämpel producera mönster med defekt webbplatser.
Medan microcontact utskrift av SAMs använda ett PDMS stämpel är mångsidig och kan vara användbar i många tillämpningar, måste ett antal avgörande steg följas för att uppnå en framgångsrik protein och cell instängdhet. För att få bra protein och cell instängdhet, måste guld substrat beredas av elektronstrålebehandlade nedfall, eftersom termisk avdunstning leder till grova guld ytor som inte stöder riktig monolager bildas. Dessutom har vi funnit att hur glassubstrat är förberedd för titan och guld nedfall påverkar också kvaliteten på guld substrat och monolager stabilitet. Medan glas substrat kan rengöras för deponering med hjälp av en mängd olika tekniker, inklusive kokande metanol, "piraya", 11 och "ormvråk" lösning, 12 i våra händer täckglas utarbetats av plasma-oxidation är vida överlägsna täckglas rengörs med andra metoder. Vi har observerat att lösningsmedel, syra och bas-baserade rengöring metoder ger monolager med minskad temporal stabilitet och ett ökat antal fel platser.
Exakt stämpling teknik som krävs för att producera optimala protein och cellulära mönster varierar beroende på storleken och formen på funktioner som ska stämplas och bildförhållande stämpeln. Normalt måste den exakta stämpling teknik för varje ny stämpel optimeras och stämpling teknik förbättrar efter flera försök. Tillämpa för mycket tryck under stämpling kommer att leda till stämpel kollaps, vilket är benägen att hända med frimärken som innehåller större bildformat (figur 7C). Alternativt gäller för lite tryck resulterar i partiell mönster överföring (Figur 7b). Det är också möjligt att dra fördel av stämpling teknik för att något förändra funktionerna i mönstret. Till exempel har vi funnit att funktioner lätt kan ökas i storlek genom stämpling under längre tid och andra har rapporterat att dimensioner för vissa funktioner kan minskas med hjälp av nedsänkta tekniker microcontact utskrift. Fastna under stämpeln 15 Ofta luftbubblor när utföra nedsänkt prägling, dock kan denna teknik ger bäst resultat när små funktioner i kombination med stora bildformat önskas.
Det finns många fördelar med att använda microcontact utskrift i kombination med egna sammansatta monolager kemi. När direkt utskrift proteiner på substrat har konformationsändringar visats förekomma 16 hänförliga till det steg där proteiner torkas under stämpling processen. Denna torkning steg är tänkt att leda till proteinaggregering och denaturering, vilket i sin tur påverkar proteiners funktion. I SAM-systemet, proteiner adsorberar till underlag från en buffrad lösning, identisk med hur substrat vanligtvis är förberedda för cellodling. Dessutom gör microcontact utskrift av proteiner inte uppnå cell isolering under längre perioder, på grund av bristen på protein resistenta bakgrunden molekyler. 17 Däremot innebär användning av en glykol bakgrund monolager för utmärkt instängdhet. 5 I de fall där användningen av en guld-substrat är antingen inte är möjligt eller önskvärt, kan Trichlorosilane monomerer utnyttjas istället för att möjliggöra protein och cell instängdhet. 9 Medan det finns metoder för isolering av proteiner och celler som inte förlitar sig på microcontact utskrift, dessa metoder tenderar att vara mer arbetsintensiv och inte mottaglig för att producera ett stort antal identiska substrat krävs normalt för biologiska studier. 18,19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka för hela Maurer gruppen vid Washington University, vars samlade kunskap har gjort detta protokoll möjligt. Finansieringen av detta arbete är från National Institute of Mental Health (1R01MH085495).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science, Inc. | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR international | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium piecesKamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR international | 52858-000 | |
| DPBS | VWR international | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR international | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
- Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication. Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).
- Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning. Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).
- Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A.
- Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication. J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).
- Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).
- Prime, K. L., Whitesides, G. M. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).
- Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration. Langmuir. , 17733-17738 (2010).
- Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).
- Yanker, D., Maurer, J. Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth. Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).
- Johnson, D., Maurer, J. Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture. Chemical Communications. , 520-522 (2011).
- Herne, T., Tarlov, M. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces. J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).
- Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon. J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).
- Johannes, M., Cole, D., Clark, R. Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography. Applied Physics Letters. , (2007).
- Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. Submerged microcontact printing (SμCP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps. Langmuir. , 12060-12063 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. , 2059-2067 (1997).
- Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing. Langmuir. , 5154-5158 (2005).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).
- Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C.
- Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light. Langmuir. , 9080-9088 (2004).
