Summary
金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。
Abstract
マイクロコンタクトプリンティングは、直接タンパク質、2 DNA、3、シラン、4自己の形成を含む分子の多数を、印刷するために採用できるが、マイクロコンタクトプリンティングは。明確に定義されたパターニング基板を作成するための迅速な、再現性の高い方法を提供する1金の上に長鎖アルカンチオールの組織化単分子膜は、（SAM）が接着剤と抵抗性領域を含む特定のパターンにタンパク質および細胞を閉じ込める簡単な方法を提供します。この閉じ込めは、細胞形態を制御するために使用され、タンパク質や細胞生物学のさまざまな質問を調べるときに有用であることができる。ここで、我々は、細胞の研究のための明確に定義されたタンパク質のパターンを作成するための一般的な方法を説明します5このプロセスは3つの手順を実行します。。のフォトリソグラフィを用いたパターニングされたマスターの製造、PDMSスタンプの作成 、およびマイクロコンタクトプリンティング金を、コーティングされた基板。一度パターン化された、これらの細胞培養基板は閉じこめタンパク質および/またはパターンの細胞（プライマリーセルまたはセルの行）が可能です。
自己組織化単分子膜の化学の使用は、パターン化されたタンパク質/細胞接着領域と非接着領域を正確に制御することができますが、これは、直接タンパク質のスタンプを使用して達成することができます。 Hexadecanethiol、マイクロコンタクトプリンティングのステップで使用される長鎖アルカンチオールは、容易に解から蛋白質を吸着する疎水性表面を生成します。基板の非印刷領域を埋め戻しに使用されるグリコール終端チオールは、タンパク質吸着、したがって細胞増殖に耐性が単分子層を作成します。6は、これらのチオール単量体が正確にサポートすることができる基板の領域を定義する高度に構造化された単分子膜を生成するタンパク質吸着と細胞増殖。その結果、これらの基板は、マイクロエレクトロニクスの創造に細胞間の動作7の研究から様々なアプリケーションに有用です。8
単分子層の化学の他のタイプを直接ガラス基板上にパターンを作成するトリクロロシランを用いて我々のグループからの作業を含む細胞培養研究用に使用されているが、金にアルカンチオールから形成された9柄の単層は、準備にストレートフォワードです。また、単層の調製に用いられるモノマーは、安定して市販されており、不活性雰囲気下で保管または処理は必要ありません。アルカンチオールから調製したパターニングされた基質は、細胞の閉じ込めを維持し、数回のリサイクルおよび再利用することができます。10
Protocol
1。パターンドマスター（図1）の調製
- 中央スピンコーター上にシリコンウエハと表1の2サイクルのスピンプログラムの初期段階中に、アセトンでウェハをすすぐ。アセトンは清潔で乾燥したウェハを残しスピンプログラムの第二段階の間に蒸発する。
- 表1に記載の条件を使用してウェハとスピンコートして約1 mLのAZ9245フォトレジスト/で（直径）適用されます。
- ソフトベーク110でフォトレジストでコーティングされたウエハ·高均一性のホットプレートを使用して2メートルのためのC。
- Photopatternどちら直接書き込みリソグラフィシステムやマスクアライナシステムと適切なマスクを用いて基板。マスクは商業的供給源の数から購入することができます。さらに、光学フラットに録音されたUV吸収剤、インク、、と印刷されたOHPフィルムは、大きな特徴でパターンを生成するために使用することができます。
- 穏やかに撹拌で1メートル45秒のために半導体グレードの脱イオン水：1:2 400K開発者のパターン付きウェーハを開発する。半導体グレードの脱イオン水と窒素の流れ（N 2）ガスを用いたドライで十分にすすいでください。パターンの開発は、UVフィルターを顕微鏡を使って確認することができます。パターンが完全に開発されていない場合は、ウェハは、追加の時間のための現像液に戻すことができます。
注：最適な結果を得るために、光パターニングは、クリーンルーム環境で行われるべきである。
2。 PDMSスタンプの調製（図2）
- 重量の樹脂で10:1の準備：Sylgard 182（PDMS）の硬化剤の混合物と完全に使い捨てペトリ皿の混合物とマスターを（光パターン形成ウェハ）をカバー。
- 脱ガスPDMS -覆われていない泡が表示されていないとスタンプが1.5時間65℃のオーブンで硬化するようになるまで真空デシケーターでマスターする硬化する前に、それは脱ガス処理工程中に表面に上昇する可能性があるため、マスターが皿の底にあることを確認が重要です。
- マスターのPDMSスタンプを切り出し、適切なサイズにトリミング。ほこりや破片から保護するために蓋をした容器（アップ機能の側）にスタンプを保管してください。
3。パターン付金基板の調製（図3）
- は25mmを準備していません。 10mのための酸素プラズマを用いる処理による金属の析出のための1ラウンドガラス製カバースリップ各ステップの間にN 2ガ ス流で乾燥、二回、エタノールとそれに続く18.2MΩ脱イオン水で2回リンスします。
- マルチポケット電子ビーム蒸着システムを使用して、預金50Åのチタンは、150Åの金が続く。チタン層と金層の堆積の間に蒸発器を発散しないでください。また、金でコーティングされたカバースリップは、サプライヤーの多様から購入することができます、しかし、金属層を電子ビーム蒸着ではなく、熱蒸着によって準備されていることが重要です。使用前に11：外部のソースから購入された場合、金基板はプラズマ酸化または"ピラニア"（30％H 2 O 2。7時03濃H 2 SO 4）で洗浄することができる。
注："ピラニア"ソリューションは、有機化合物の存在下で爆発的です。
- スタンピングソリューション、無水エタノール中の10mM hexadecanethiol、および埋ソリューション、無水エタノール中の1mMグリコール終端チオールを準備します。
- エタノールでスタンプをすすぎ、N 2ガ スで十分に乾燥させます。完全にコーティングされるまで滴下PDMSスタンプへのソリューションをスタンピング適用されます。 N 2ガ スで十分にスタンプを乾かします。 PDMSスタンプの機能に基づいて適切に5aあるいは5bに進んでください。
- ゆっくりと金基板上にスタンプを押して、単分子層が15秒のために形成することができます
- 基板が水没されることを保証、18.2MΩ脱イオン水を含むペトリ皿に金基板を置きます。ゆっくりと金基板上にスタンプを押して、単分子層が15秒のために形成することができます
- それぞれのすすぎとペトリ皿の中で基板を配置した後、N 2ガ スで乾燥、エタノールで2回スタンプ付き基板をすすぐ。
- 埋め戻しソリューションで基板を覆い、蒸発を防ぐためパラフィルムで料理を封印。
- 背景の単分子層は12〜14時間にわたって暗所で形成することができます
- 埋め戻しソリューションからパターン化されたカバースリップを削除し、各洗浄後、N 2ガ スで乾燥、エタノールで2回すすいでください。
4。パターン基板へのタンパク質や細胞の適用
- 小さなペトリ皿やダルベッコのリン酸の500μL〜1 mLの細胞培養容器と蓋の模様のカバースリップが（DPBS）緩衝生理食塩水に置きます。 DPBSは完全であってもタンパク質のカバレッジを確保するためにタンパク質のインキュベーションの間に基板をカバーする必要があります。
- DPBSにタンパク質の濃縮液を追加し、パイプによるソリューションを混在させるティン数回。 37℃で基質とタンパク質の混合物をインキュベート℃で1時間ラミニンおよびフィブロネクチンの最終的な濃度は、それぞれ、通常12μg/ mLとし、20μg/ mLとなります。タンパク質は、簡単なパターンの可視化を可能にするためにアミン反応性蛍光色素で標識することができます。タンパク質標識が生物学的活性を妨げることができるしかし、標識タンパク質は未標識タンパク質と1:1で混合されるべきである。
- インキュベーション後、基質を乾燥させたり、空気 - 水界面を介して持参しないように注意しながら、未結合のタンパク質を除去するためにDPBS（4〜5倍）で十分に基板をすすぐ。最初の三つ洗浄した後、湿った基板を維持するために、完全な細胞の増殖培地の約500μLを加える。
- 新鮮な培地を用いて基板を洗浄するために使用される増殖培地を交換してください。
- 解離し、基板上にメッキするためのセルを数える。このような海馬ニューロン、またはそのようなCHO - K1細胞のような不死化細胞株、、として解離初代細胞、どちらを利用することができる。
- 基板上にプレート解離細胞。通常は30〜200細胞/ mm 2のが使用されます。
5。代表的な結果：
図1。パターニングされたマスターのフォトリソグラフィ準備のための一般的な回路図。このプロセスでは、シリコンウェハは、アセトンで洗浄され関心のパターンに露光されたフォトレジストで被覆し、パターンが開発されています。
図2。PDMSスタンプの準備のための一般的な回路図。 、60℃のオーブンで硬化、真空デシケーター中で脱ガス処理、およびサイズにカット：このプロセスでは、パターニングされたマスターは、Sylgard（硬化剤10時01樹脂）で覆われている。
図3。基板のパターニングのための一般的な回路図。このプロセスでは、ガラス基板は、電子ビームグリコール終了アルカンチオールを充填PDMSスタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングhexadecanethiolによってパターン化された蒸発器、、、および蛍光標識したタンパク質でコーティングを用いてチタン（50A）とゴールド（150A）でコーティングされています。
図4パターンドマスター（A）とPDMSスタンプは、（B）に記載の方法を用いて調製。スケールバーは100μmのです。
図5。パターン化SAMのはAlexaFluor 647 -標識されたフィブロネクチン（A）とCHO - K1細胞の閉じ込め（B）で可視化した。スケールバーは100μmです。
図6 in vitroでの 4日間でE18マウス海馬神経細胞でパターンラミニンシード。 AlexaFluor 350 -標識抗ラミニン抗体は、パターンの可視化のために使用されます（）およびE18マウス海馬ニューロンは、MitoTrackerによりレッド580（B）で染色されています。スケールバーは100μmです。
図7。パターニングされた基板を準備中の潜在的な落とし穴がAlexaFluor 647 -共役フィブロネクチン吸着により可視化。不均一なタンパク質吸着に（A）不十分な混合リード。部分的な木靴の転送にリード線をプレス時の圧力の（B）不均等なアプリケーション。 （C）プレス時の圧力をかけすぎると崩壊をスタンプする可能性があります。 （D）すすぎ時の空気の水界面へのパターン化表面の露出は、バックグラウンドタンパク質の吸着が発生する可能性があります。スケールバーは100μmです。
図8。水中パターニングは、空気中の従来のマイクロコンタクトプリンティングによって印刷することが困難な小さな機能を持つパターンを生成することができます。画像（A）と（B）空気中の同じPDMSスタンプ（A）または脱イオン水（B）で印刷された同じパターンの異なる地域を、示す。パターンを囲む10μmの幅のサポートラインは、（タイムスタンプの崩壊を防ぐために追加された）（）で見られている、しかし、図に示すように小さなドットの機能は、（B）表示されません。これは、空気中の印刷が大きな特徴では有用ですが、水で印刷が小さい特徴を持つパターンのために必要となる場合があります示しています。スケールバーは20μmである。
| サイクル | 加速レート（回転数/秒） | 最終的なスピード（rpm） | 時間（s） |
| 1 | 500 | 1000年 | 5 |
| 2 | 3800 | 3800 | 30 |
表1。シリコンウェハ上にAZ9245の4.5μmの厚さのコーティングを作成するために使用される2つのサイクルのスピンプログラム。
パターニング基板の形成のためのPDMSスタンプを準備するには、フォトレジストのマスターは、まず（図1及び図4A）製造されています。マスターは、スタンプの逆数であり、どちらかの直接書き込みリソグラフィシステムやマスクアライナを使用して作成されます。このようなAZ9245としてポジ型フォトレジストは、、マスターの生産に使用される場合、レジストコートされたウェハは、最終的な基板上に表示される同じパターンで光にさらされている。それは常に可能ではないが、それはPDMSスタンプのマスターに最適なアスペクト比（厚さに抵抗する機能のサイズ）が1:2であることが報告されている。13我々は性質に応じて、1:40のアスペクト比が可能であることを発見したパターンの。条件下でのAZ9245被覆されたシリコンウェーハは、4.5μmの公称厚さのフォトレジストを与えるここで説明する。我々はAZ9245のこの厚さは> 100ミクロンから2ミクロンまでの機能を持つPDMSのマスターを生成するために使用できることを見出した。
PDMSスタンプは、フォトレジスト（図2）から作製マスターを使用してSylgard 182（またはSylgard 184）からキャストされます。フォトレジストのマスターは、同じタイムスタンプの多くのコピーを作成するために、複数回使用することができます。硬化PDMS後は、スタンプがカミソリの刃と、結果のタイムスタンプを使用してマスターから削除されているガラスカバースリップ（図4B）にスタンプ機能の側を下に置くことにより、顕微鏡下で可視化することができる
蛍光標識された蛋白質（図3、図5）のアプリケーションで視覚化できる、シャープでクリアな蛋白質パターンの適切なスタンピング結果。また、免疫組織化学は細胞固定後のタンパク質のパターン（図6）を視覚化するために使用されることがあります。細胞増殖はよく不死化細胞株および初代培養細胞（図5および6）の両方のタンパク質のパターンに限られている。
このテクニックは簡単にマスターされている一方で、いくつかの一般的な問題が発生する可能性があります。 DPBSで濃縮タンパク質溶液の十分な混合することなくタンパク質のアプリケーションは、不均一なタンパク質パターン（図7A）につながることができます。不適切なスタンプは、部分的なパターン転写やスタンプの崩壊（図7B - C）につながることができます。さらに、空気に吸着したタンパク質を含むパターン化基板を露光するバックグラウンドの減少抵抗（図7D）のマニュアルページを引き起こして単分子層を破壊することができます。非常に小さい特徴（<5μm）と高アスペクト比で構成されるパターンは、多くの場合、水中マイクロコンタクトプリンティングを使用する必要があります。この手順（3.5b）水で（図8）パターンの外で基板上に堆積からhexadecanethiol防ぐために障壁として使用されます。14
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Discussion
問題の数は、PDMSスタンプの作成に使用されるマスターのリソグラフィ製造で発生することができる。ぼんやりと不明瞭なパターンと拡大または欠落している機能は、レジストコートされたウェハの結果の露出過度のレジストコートされたウェハの結果の露出不足。小さな機能を持つマスターが光パターニングと開発のパラメータ（フォトレジストメーカーが推奨するパラメータを超えて）の広範な最適化を必要とすることができますが、一般的に、大きな特徴のサイズが（> 10ミクロン）を持つマスターは、パターンには比較的容易であり、開発する。大と小の両方の機能を組み合わせる生成するために最も困難なマスター。
マスターからPDMSスタンプの作製には、セクション2で説明した手順を使用して簡単です。しかし、完全にSylgard 182の2つのコンポーネントを混在させることに注意する必要があります。コンポーネントの完全な混合を達成するために障害が硬化スタンプとマスターの可能性破壊に無効になることがあります。過剰な力が使わまたはねじれが分離時に発生している場合PDMSスタンプからそれを分離するときにさらに、マスターが破損することがあります。マスターは、スタンプを削除するプロセスで解読したならば、それはまだエタノールで洗浄した後、スタンプを使うこともできます。しかし、この切手は、欠陥部位を持つパターンを生成することがあります。
PDMSスタンプを使用してSAMのマイクロコンタクトプリンティングは万能であり、多くのアプリケーションで有用かもしれないが、重要なステップの数は、成功したタンパク質や細胞の閉じ込めを達成するために従う必要があります。熱蒸発が適切な単層の形成をサポートしていないラフな金表面となるため、良好な蛋白質と細胞の閉じ込めを取得するには、金基板は、電子ビーム蒸着法により作製されている必要があります。また、我々はどのようにガラス基板がチタンと金の堆積のために準備されていることを発見したにも金基板と単層の安定性の品質に影響を与えます。ガラス基板をプラズマ酸化により調製された私たちの手で12はカバーガラス、沸騰メタノール、"ピラニア"、11、"ノスリ"のソリューションを含む技術のさまざまな、使用して堆積のために洗浄することができますが、他の方法を使用してきれいにカバースリップよりはるかに優れています。我々は、溶剤、酸、および塩基系の洗浄方法が減少時間的安定性と欠陥のサイト数の増加と単分子膜を与えることを観察した。
最適な蛋白質と細胞のパターンを生成するために必要な正確なスタンプ技術は、スタンプする機能やスタンプのアスペクト比の大きさや形状によって異なります。一般的に、それぞれの新しいスタンプの正確なスタンプ技術は、最適化とプレス技術は、いくつかの試験の後に改善されている必要があります。スタンピング中に過剰な圧力を適用すると、大きなアスペクト比（図7C）を含む切手で発生する傾向がある崩壊を、スタンプにつながる。また、部分的なパターン転写（図7B）の少なすぎる圧力の結果を適用する。それは、少しパターンの特徴を変更するスタンピング技術を活用することも可能です。例えば、我々は特定の機能の大きさは、水中マイクロコンタクトプリンティング技術を用いて低減できることが報告されている。15多くの場合、気泡がなる切手の下に閉じ込められた時の機能は若干の時間と他より長い期間のスタンプすることで、サイズを大きくすることが可能なことを発見した水中スタンピングを行うと、しかし、この手法は、大きなアスペクト比と一緒に小さな機能が望まれている最良の結果を与える可能性があります。
自己組織化単分子膜の化学と一緒にマイクロコンタクトプリンティングを使用することには多くの利点があります。直接基板上にタンパク質を印刷する場合は、コンフォメーション変化は、蛋白質はスタンピングプロセスの間に乾燥しているステップに起因する16を発生することが示されている。この乾燥工程は、順番に、タンパク質の機能に影響を与える蛋白質の凝集や変性につながると考えられている。 SAMシステムでは、タンパク質の緩衝水溶液から基板への吸着、基板は、通常、細胞培養のために準備されている方法と同じ。さらに、タンパク質のマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質抵抗性のバックグラウンド分子の不足しているため、長期間細胞の閉じ込めを実現していません。17これとは対照的に、グリコールの背景の単分子膜の使用は、優れた閉じ込めのために用意されています。5ではケースで金基板のいずれかの可能性または望ましくないでない、トリクロロシランモノマーが蛋白質と細胞の閉じ込めを可能にするために代わりに利用することができる。9マイクロコンタクトプリンティングに依存しないタンパク質および細胞の閉じ込めのための方法がありますが、これらのメソッドは、になりがちより多くの労働集約的と一般的に生物学的研究に必要な同一の基板を大量に生産するに従順ではありません。18,19
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、その蓄積された知識は、このプロトコルを可能にしたワシントン大学で全体マウラーのグループに感謝します。この仕事のための資金は、国立精神衛生研究所（1R01MH085495）によって提供されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science, Inc. | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR international | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium piecesKamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR international | 52858-000 | |
| DPBS | VWR international | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR international | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
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