In vivo dupla Substrato Bioluminescent imagem

Summary

Aqui, descrevemos os métodos para construir, visualizar e quantificar as reações bioluminescentes de ambos vagalume e Renilla enzimas luciferase expressos em células de câncer de mama metastático durante o seu crescimento e metástase

Abstract

Nossa compreensão de como e quando as células do câncer de mama trânsito de tumores primários estabelecidos para locais metastáticos tem aumentado a um ritmo excepcional desde o advento da in vivo bioluminescente tecnologias de imagem ^1-3. Com efeito, a capacidade de localizar e quantificar o crescimento do tumor longitudinalmente em uma única coorte de animais para a conclusão do estudo, em oposição a sacrificar a grupos individuais de animais em tempos de ensaio específicas revolucionou como os pesquisadores investigar a metástase do cancro da mama. Infelizmente, as metodologias actuais impede a avaliação em tempo real das alterações críticas que ocorrem em sistemas de sinalização celular, como as células do cancro da mama (i) evoluir dentro de tumores primários, (ii) disseminar por todo o corpo, e (iii) reiniciar programas proliferativas em locais de um metástase. No entanto, os recentes avanços na imagem de bioluminescência agora tornam possível quantificar simultaneamente spatiotempor específicaal mudanças na expressão de genes, como uma função do desenvolvimento do tumor e de progressão metastática, através do uso de reacções de luminescência dupla de substrato. Para fazer isso, os investigadores aproveitar para duas enzimas que produzem luz de luciferase isoladas do pirilampo (Photinus pyralis) e amor-perfeito do mar (Renilla reniformis), ambos os quais reagem a substratos que se excluem mutuamente, que anteriormente facilitada a sua utilização generalizada na célula em vitro baseados em ensaios de gene repórter ^4. Aqui demonstramos a utilidade in vivo das duas enzimas tais que uma reacção luminescente especificamente marca o tamanho e local de um tumor em desenvolvimento, enquanto que a segunda reacção luminescente serve como um meio para visualizar o estado de activação de determinados sistemas de sinalização durante os estágios distintos de tumor e desenvolvimento de metástases. Assim, os objetivos deste estudo são duas vezes. Primeiro, vamos descrever os passos necessários para a construção de linha de celular dual bioluminescente repórters, bem como os necessários para facilitar a sua utilização na visualização da regulação da expressão do gene spatiotemporal durante os passos específicos da cascata metastática. Utilizando o modelo de 4T1 de metástases do cancro da mama, que mostram que a actividade in vivo de um elemento de ligação sintético Smad (SBE) promotor diminuiu dramaticamente em metástase pulmonar em comparação com a medida em que o tumor primário ^4-6. Recentemente, a metástase do cancro da mama demonstrou ser regulada por alterações no microambiente do tumor primário e estroma reactivo, incluindo aqueles que ocorrem em fibroblastos e células infiltrantes imunes ^7-9. Assim, o nosso segundo objectivo será o de demonstrar a utilidade de duas técnicas de bioluminescência no controlo do crescimento e da localização das duas populações de células únicas abrigado dentro de um único animal durante o crescimento do cancro da mama e metástases.

Protocol

1. Expressão estável de CMV-Driven Luciferase Renilla

1. Transfecção e selecção de uma população clonal estável é o método preferido para a expressão deste repórter luciferase Renilla. Esta abordagem proporciona um mais consistente e uniforme, a expressão da luciferase de Renilla, após a introdução subsequente de outras construções repórter secundário (por exemplo, luciferase de pirilampo ou proteínas fluorescentes).
2. Transfectar as células malignas de interesse com a expressão de luciferase de Renilla vector que codifica, como pcDNA3.1-Hygro ou outro plasmídeo marcador seleccionável um.
3. Após transfecção, coloque os transfectantes com uma concentração de antibiótico optimizado para vários dia-a-semana a fim de facilitar o isolamento de colónias individuais, as quais são subsequentemente isolados individualmente e subcultivadas.
4. Seleccione ≥ 10 individuais Renilla luciferase expressam colónias para monitorizar a extensão da expressão de Renilla.
(i) fisiopatológicos de suas contrapartes parentais são retidos, e (ii) os valores de expressão Renilla não se desviem ou mudar com o tempo. Estes passos são absolutamente essenciais para evitar isolar e estudar variantes clonais / desviantes, e para validar a integração adequada do arquétipo Renilla no genoma.
5. Uma vez que um transfectante estável é isolado e verificado, pode-se remover a pressão selectiva e estar certo de que a expressão de luciferase de Renilla permanecerá constante durante longos períodos de tempo, tanto in vitro como in vivo.

2. Expressão, seleção e verificação funcional do Promotor induzível-Driven Firefly luciferase

1. Subclonar o promotor de interesse para um repórter de luciferase pGL4 plasmídeo portador de um marcador seleccionável (por exemplo, puromycin) que é diferente do que é utilizado para seleccionar para a expressão estável de Renilla (por exemplo, a higromicina).
2. Transfectar células malignas tal como no Passo I, e, subsequentemente, para seleccionar uma população estável policlonal de luciferase do pirilampo células que expressam. Porque o local onde um gene relatório integra no genoma pode provocar efeitos erradas em sua expressão e regulação, recomenda-se fortemente para selecionar para as populações policlonais de Firefly luciferase células que expressam ao contrário de populações clonais para assegurar que (i) a expressão do gene repórter reflecte melhor que a do gene endógeno em células parentais, e (ii) efeitos na expressão do gene de integração são calculados e diminuída através da população celular heterogénea.
3. As células malignas projetados para expressar de forma estável tanto Renilla e luciferases vaga-lume são colectivamente referidos como dupla células repórter bioluminescentes, ou células DBR.
4. Usando <tradicionalem> in vitro de células com base em ensaios de gene repórter de luciferase, verificar que as células do DBR regulam a expressão de luciferase do pirilampo, positiva ou negativamente, de um modo concordante com o observado em células parentais transitoriamente transfectadas com estes vectores. Da mesma forma, verificar que o CMV-driven expressão de Renilla não é regulada por estímulos de células diferentes ou condições de tratamento.
5. Para isso, a cultura e as células parentais DBR em placas de 24 poços, e, subsequentemente, transientemente co-transfectar as células parentais com o original CMV-Renilla e promotor-firefly construções usadas para gerar células de DBR.
6. Depois disso, o tratamento DBR e transfectadas células parentais com factores ou agentes farmacológicos conhecidos para regular o promotor de interesse, e, subsequentemente quantificar pirilampo e da Renilla usando o Promega luminescência Kit de ensaio de luciferase duplo.

3. Estabelecer 4T1 primárias tumores mamários

1. Metastático 4T1 células de carcinoma mamário quere encontrada para agentes patogénicos falta adventícias roedores foram projetadas para expressar de forma estável uma luciferase Renilla CMV-driven (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferase-hygro) e um SBE-driven luciferase de pirilampo (pGL4.2-SBE-luciferase do pirilampo-puro) como descrito acima. Enxerto ortotópico destas células de cancro da mama, resulta na formação de metástases espontâneas principalmente nos pulmões.
2. Células 4T1 não deve ser deixada atingir a confluência, durante a sua propagação em 2 dimensões tradicionais sistemas de cultura de tecidos, e que devem ser passadas no dia anterior a sua inoculação em vivo.
3. Células 4T1 deve ser dissociada por tripsinização, lavados em meio de crescimento, e diluído em PBS para uma concentração de 2x10 ⁵ células / ml e imediatamente armazenados em gelo.
4. Fêmeas Balb / C fêmeas (4-6 semanas de idade) devem ser anestesiados com uma dose de indução de 3% de isoflurano e mantidos sob anestesia com uma dose de 1% de isoflurano. Prepare o local da injecção limpando com70% de álcool isopropílico. Usando uma pinça, gentilmente segure e levante a almofada inguinal 4 mamária. Com cuidado, coloque um medidor de 27,5 lado bisel da agulha e injetar-se na almofada mamária gordura diretamente sob o mamilo, tendo especial cuidado para não empurrar a agulha na cavidade abdominal. Libertar a glândula e injectar lentamente 50 ul da suspensão de células (1x10 ⁴ células) na almofada de gordura mamaria.

4. Imagem dupla inicial Luminescent

1. Imediatamente após enxerto de células 4T1 para a almofada de gordura mamaria e quando os ratos são ainda anestesiados, injectar 100 ul de celenterazina RediJect na veia lateral da cauda. Esta é a concentração de substrato óptimo recomendado pelo fornecedor e melhor tolerados pelo animal.
2. Imediatamente coloque o mouse no cone do nariz isoflurano dentro do sistema de imagem IVIS-200 e adquirir uma imagem 0,5-1 minutos luminescente. Eficiência entre a injecção ea aquisição de imagem é muito importante, como o sinal depara a luciferase Renilla cai precipitadamente ~ 30 segundos após a injecção. Posicione o mouse de volta para sua gaiola e permitir que ele se recuperar por ≥ 1 hora, o que garante que qualquer sinal luciferase residual Renilla se dissipou e que o mouse está totalmente recuperado da anestesia.
3. Administrar 150 mg / kg de D-luciferina sal de potássio através de injecção IP e esperar 5 minutos. Esta é a concentração ideal de D-luciferina, que fornece um sinal luminescente estável durante 5-15 minutos após a sua injecção em animais de teste. Anestesiar o rato usando isoflourane e substituir no IVIS-200, tendo o cuidado de colocar o animal em uma posição muito semelhante em relação à aquisição original Renilla. A intensidade deste sinal global firefly irá depender da actividade do promotor de interesse, e, como tal, a actividade de luciferase de pirilampo podem visualizar requerem tempos de aquisição prolongados.
4. Usando o software IVIS imagem viva definido como "fótons" modo, estabelecer values, tanto para a Renilla e aquisições firefly como um meio para estabelecer relações de linha de base em relação de luminescência (RLR).

5. Longitudinal Luminescent imagem

1. Células 4T1 são altamente agressivo, tal que a inoculação de 1x10 ⁴ células, tipicamente, leva à formação de tumores palpáveis ​​dentro de 1 semana, e com a letalidade do animal dentro de 4-5 semanas. Tumores 4T1 têm uma tendência inerente ulceram na semana 4. O crescimento e a manutenção de tumores ulcerados requerem aprovação IACUC separado. Os estudos de tumores 4T1 aqui apresentados foram aprovados pelo IACUC na Case Western Reserve University.
2. Como descrito acima, deve ser injectado ratinhos semanalmente com coelenterazina RediJect para monitorar o crescimento de tumores e metástases em geral, bem como com D-luciferina para monitorar via específica de sinalização durante várias fases de desenvolvimento do tumor. Tenha o cuidado de cada vez para assegurar o sinal de luciferase Renilla foi completamente dissipado antes da aquisiçãodo sinal de luciferase do pirilampo.
3. Como tumores 4T1 desenvolver e progresso, Renilla luciferase aquisições devem ser normalizados para os valores iniciais de Renilla medidos no momento da inoculação de células tumorais, como um meio para normalizar e controlar o crescimento do tumor primário. Mais importante ainda, o cálculo dos valores RLR ao longo do tempo irá estabelecer a regulação temporal de sistemas de sinalização individuais relativos ao crescimento do tumor e de progressão.
4. Metástase pulmonar manifesta torna-se aparente dentro de 3-4 semanas após o enxerto de células 4T1 para a almofada de gordura mamaria. Comparando os valores RLR pulmonares versus aqueles calculados para o tumor primário estabelece a regulação espacial de sistemas individuais de sinalização relativas ao crescimento de tumores e metástases.

6. Imagem Bioluminescent dupla de dois tipos de células únicas em um único animal

1. Engineer uma linha celular de cancro da mama para estavelmente luciferase Renilla expressão CMV-driven como descrito acima. Repita esteprocesso de engenharia usando CMV-driven luciferase firefly em uma distinta linha de mama segunda célula cancerosa.
2. Aqui nós misturado Renilla luciferase-expressando células 4T1 com as suas metástases e isogénica luciferase do pirilampo que expressam homólogos 4T07 ^{10, 11.} Estas razões variáveis ​​de populações mistas de células de cancro da mama são posteriormente injectado na almofada de gordura mamaria, conforme descrito acima.
3. Imediatamente adquirir tanto vaga-lume e Renilla imagens luciferase para estabelecer representante RLRs inicial de uma mistura determinada célula inoculado.
4. Imagiologia bioluminescente dupla longitudinal irá visualizar e controlar as alterações na composição celular dentro do tumor primário, bem como o espaço temporal metástase de cada derivado do cancro da mama em relação ao crescimento e progressão tumoral.
5. Alternativamente, as populações de células individuais da mama cancro podem ser inoculadas em diferentes locais no rato (ou seja, os direitos e esquerdos mamárias almofadas de gordura abdominal)para avaliar a influência sistémica nestas duas populações apresentam uma sobre a outra durante as várias etapas de crescimento de tumores e metástases.

7. Resultados representativos:

A maior força de imagiologia bioluminescente dupla encontra-se no facto de cada imagem é internamente consistente e controlada, de tal modo que os sinais contínuos derivados da função tumor primário como uma métrica importante para medir o sucesso ou a falha de cada Renilla e aquisição do pirilampo. Este aspecto do procedimento de imagem é particularmente importante durante a aquisição da actividade da luciferase de Renilla, cuja celenterazina substrato é altamente sensível à oxidação que resulta na sua capacidade de auto-luminescência. A Figura 1A mostra um exemplo deste efeito colateral, a qual se manifesta como imediatamente inespecíficas sinais luminescentes derivados a partir do tracto intestinal e não o tumor primário estabelecido. Normalmente, esses celenterazina inespecífica sinaliza transpirseguinte e falhou injecções intravenosas de este substrato Renilla luciferase. No entanto, uma vez que os sinais robustos primárias derivadas de tumor Renilla foram obtidos (Figura 1B, a imagem esquerda), é seguro para continuar a capturar as medições da via de sinalização específicos derivados de imagiologia luciferase de pirilampo (figura 1B, painel da direita), cuja D-luciferina substrato é altamente estável após a injecção IP e produz níveis negligenciáveis ​​de fundo auto-luminescência.

Figura 1. Adquirir Renilla e firefly-derivado imagens bioluminescentes para calcular em RLRs in vivo. (A) Um exemplo de uma injecção IV de celenterazina falhou resultando em sinal não específico a partir do tracto intestinal. Círculo e PT indicar a localização aproximada do tumor primário. (B) A aquisição Renilla bem sucedida de um rato tendo um tumor primário e 4T1 pmetástases ulmonary (painel esquerdo; 4wk após enxerto almofada de gordura). A aquisição de pirilampo correspondente permite o cálculo de RLRs de ambos o tumor primário e as suas metástases pulmonares. (C) Representação gráfica do tumor primário e as metástases pulmonares RLRs calculado a partir de ratos mostrados no painel B (n = 4).

Discussion

O poder absoluto de técnicas de imagem de bioluminescência reside na sua capacidade de quantificar o crescimento de tumores e metástases em complexos estudos longitudinais, que aqui envolveu o uso de células de câncer agressivo 4T1 mama. Porque estes processos dependem da integração estável de ambos os constructos de repórter de luciferase, estas técnicas podem ser prontamente adaptada e traduzida para outras linhas de células cancerosas de diferentes latências tumorais metastáticas e capacidades. Similar aos resultados apresentados no presente documento, o cálculo RLRs específicos dentro lentamente a desenvolver os tumores primários e as suas metástases eventuais permite a identificação em tempo real spatiotemporal de eventos de sinalização específicos que ocorrem durante a progressão de tumores metastáticos, independentemente do seu tempo de latência. Após a identificação dos eventos específicos do promotor de regulação, é importante tanto para extirpar o tumor primário e as suas lesões metastáticas para o desempenho de imuno-histoquímica e padrão differentiaanálises de expressão de genes para verificar l regulação semelhante do gene endógeno e / ou proteína.

Tecnicamente falando, o principal desafio da dupla análises bioluminescentes reside na duração relativamente curta dos sinais Renilla luciferase. Como tal, esta técnica de imagem requer optimização significativo do processo de injecção na veia da cauda, ​​bem como a criação de imagens imediato, de animais injectados individualmente, um processo que consome tempo e é relativamente pouco eficiente para imagiologia da luciferase do pirilampo. Recentemente, introduziu Promega "Viviren", o qual representa um substrato de luciferase de segunda geração cujos locais de oxidação são bloqueados por esterificação até esta entrada ganhos molécula nas células, altura em que a molécula seja rapidamente des-esterificada. Colectivamente, este novo substrato reduz eficazmente modificação auto-luminescência e não específica e / ou acoplado a degradação induzida por Renilla ¹² auto-luminescência. Ao fazer isso, esse novo renillum substrato de luciferase produz mais brilhantes sinais luminescentes, no entanto, os custos excessivos associados à aquisição e à utilização de "Viviren" tenha fornecido relativamente poucos estudos necessários para avaliar a utilidade geral deste substrato em duas análises bioluminescentes. Por fim, a sensibilidade de qualquer ensaio bioluminescente é criticamente dependente da câmara CCD operante em adquirir unidades de luz individuais. De fato, como estas tecnologias melhoram, prevemos um ponto no futuro onde a nossa capacidade de visualizar complexos luz reações mediadas bioluminescentes podem acontecer de forma eficiente em animais livres em movimento ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega Corp.	E6751
Glomax Mult-idection system	Promega Corp.
IVIS 200 series	Caliper Life Sciences
Dual luciferase reporter Assay system	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenterazine-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Salt	Caliper Life Sciences	122796