Summary
病原菌诊断一个简单的为期一天的工作流程方案的设计，使血液感染的快速识别。列入的8个临床相关细菌的目标和其抗生素耐药谱提供的医生就在同一天最初的洞察力，从而导致更充分的治疗。
Abstract
血液感染相关死亡率高，因为可能表现败血症，严重败血症和感染性休克1。因此，适当的抗生素治疗的快速管理是首要的重要性，在治疗血液感染。在这个过程中的关键要素是时机，在很大程度上依赖细菌鉴定和药敏试验的结果。这些参数都定期获得文化为基础的测试，这是耗费时间和平均24-48小时，2，4。这项研究的目的是开发基于DNA检测血液感染的快速识别，以及快速药敏试验。第一个实验是1真细菌16S RDNA-实时PCR检测与种属特异性探针5补充。使用这些探头，革兰氏阴性菌，包括假单胞菌，绿脓杆菌和大肠杆菌以及革兰氏阳性细菌，包括葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，肠球菌，链球菌属，肺炎链球菌可以区别开来。使用这种多功能检测，致病微生物鉴定后2小时。
其次，我们开发了一个半分子检测与药敏试验金黄色葡萄球菌，肠球菌 。 （兼）需氧革兰氏阴性菌棒6。此法是基于在其中的PCR被用来测量7细菌生长的研究。直接取血培养的细菌培养与抗生素的选择6小时，1 SYBR绿色为基础的实时PCR检测后确定的生长抑制。这两种方法的结合，可以直接选择一个合适的抗生素治疗的同一天（ 图1）。结论分子，双方鉴定及药敏分析提供了一个更快的替代方案病原体检测，并能改善血液感染的诊断。
Protocol
第一部分：病原鉴定
1。样品制备
注：在以下协议所述的整个分子的工作流程应根据建议在分子诊断质量保证3。
- 加入血培养0.1毫升分装到0.9毫升0.9％至1.5 ml反应管的NaCl成为1:10的稀释后的样品。（稀为了防止定量PCR的抑制）。
- 13400 XG离心5分钟沉淀细菌的DNA样本。
- 细菌沉淀重悬于100μL无菌矿物质的H 2 O
- 保存于4°C，直到进一步利用DNA样本。
2。鉴定检测：实时的16S rDNA PCR技术
- 准备如下的反应混合物。该法由四个不同的反应，每个样品。每个混合物包括12.50μL主混合，0.9微米正向引物（5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3），7，0.6微米的反向引物（5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3），8和面板的探头。探头的数量是每个在以下四个不同的反应。
- 第一反应包括：
- 0.2μM的通用探头（5 FAM CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）8
- 0.2μM的体育的铜绿探头（5 -乔- CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1）
- 第二个反应包括：
- 0.2μM的大肠杆菌大肠杆菌探头（5 -乔- GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1）
- 0.2μM的假单胞菌 。探头（5-NED的CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ）
- 第三个反应包括：
- 0.2μM的葡萄球菌 。探头（5-NED的AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ）
- 0.2微米的S。金黄色葡萄球菌探头（5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1）
- 0.2μM的肠球菌 。 （5 - 乔 - TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1）
- 第四反应包括：
- 0.2μM的通用探头（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）
- 0.3μM的链球菌属。探头（5-NED的CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ）
- 0.2微米的S。肺炎探头（5 -乔- CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1）
- 加入无菌去离子H 2 O，达到总量的20μL。每个反应混合物中加入20微升至96孔PCR板的井。
- 每孔加入5μL样品。
- 使用胶膜密封的96孔PCR板。
- 在ABI PRISM 7900HT实时定量PCR系统使用以下最佳的热循环条件下运行的板块：
- 在50°C加热10分钟前
- 最初在95°C变性15分钟
- 42个循环
- 在95°C变性15秒
- 在60°C退火1 min
3。结果分析
在标签分析设置，调整阈值的CT分析0.1。缩小基线配置启动（循环）：6和尾（周期）：15。
- 记录所有样品的循环阈值（CT）值。考虑PCR检测结果为阳性截止值可以设置为CT值35。血培养中存在的细菌数量为10 7 10 11 CFU /毫升，CT-值低于35的产生。
第二部分：药敏试验
4。血培养阳性9细菌的分离
- 从阳性血培养瓶吸5毫升肉汤和转移到血清分离管。
- 2000年为10分钟XG离心血清分离管。
- 倒掉上清血清分离管。
- 转让BACteria用无菌棉签管凝胶层到0.9％的盐水，直到得到0.5麦克法兰标准悬挂。
5。接种微滴度板
- 0.5麦克法兰悬挂在双集中穆勒韩丁第二肉汤稀释，以形成一个5×10 5 CFU / ml的悬浮。
- 将此悬浮微滴度板含有抗生素的选择（ 见表1）井。
- 在37°C孵育6小时微滴度板。
- 储存在4°C（负增长控制）暂停等分。
- 培养6小时后，转移到无菌管每口井的内容，以及负增长，控制样本被储存在4°C
- 16000 XG 5分钟的离心管。
- 小心取出上清液，不干扰细菌沉淀。
- 在无菌矿物质的Ĥ悬浮颗粒
- 10倍稀释样品在无菌矿物质的H 2 O
6。实时的16S rDNA PCR扩增10
- PCR混合物准备如下：
- 12.50μL的iQ SYBR Green超
- 0.5μM的正向引物16S-1（5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）11
- 0.25微米的反向引物16S-2（5 TACCGCGGCTGCTGGCAC-3）11
- 无菌去离子H 2 O的总体积20μL
- 加入20μlPCR混合物的96孔PCR板的井。
- 每孔加入5μL样品。
- 使用胶膜密封的96孔PCR板。
- 运行盘上的MyiQ™实时单色实时PCR检测系统，使用以下最佳的热循环条件：
- 最初在95°C变性4分钟
- 初始退火65℃30秒
- 35个循环
- 变性95℃15秒
- 在60°C退火1 min
- 熔解曲线分析（60-95°C的20分钟增量为0.57°C）
7。结果分析
- 计算截止的Ct值，使用下列公式（抗生素类型而定）之一。
- 一般情况下：
截止Ct值= Ct值正增长，控制+ 0.5×（Ct值负增长控制- Ct值正增长，控制） - 哌拉西林，哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶在革兰氏阴性菌棒，阿莫西林，苯唑西林的金黄色葡萄球菌的甲氧苄啶/磺胺甲恶唑;在肠球菌阿莫西林： 切断Ct值= Ct值正增长，控制+ 0.25×（Ct值出现负增长。控制- Ct值正增长，控制）
- 一般情况下：
- 使用培养用无菌去离子H 2 O为正增长，控制样品。
- 根据微生物，使用适当的负增长控制：
- 革兰氏阴性菌棒样品的培养与抗生素的混合物
- 肠球菌样品储存在4°C
- 金黄色葡萄球菌样品储存在4°C
- 确定的易感性（S）或电阻（R）的测试如下抗生素的应变：
- 一个CT值高于截止Ct值表示易感性
- 一个CT值低于截止Ct值表示电阻
8。代表结果
两个模式生物，即革兰氏阴性菌E.大肠杆菌和革兰氏阳性与金黄色葡萄球菌 ，选择可视化合并过程的检测和识别细菌病原体和测定其抗菌简介。该协议的第一部分包括病原鉴定。 SPEcific探针被设计为8个临床相关的微生物的检测。在存在细菌面板中包含的目标，扩增曲线的生成和计算CT值（ 图2）。考虑PCR检测结果为阳性截止值设置为35 Ct值。 图2A中， 大肠杆菌感染的血培养鉴定的个人资料显示。 16S通用探针包含两个独立的反应混合物，从而产生两个扩增曲线（25.20和25.95克拉）。第三个信号是来自E.探头具体大肠杆菌 （CT，27.04）。一个与鉴定金黄色葡萄球菌感染的血培养如图2B所示。 16S通用探针33.35和33.71的放大信号。剩下的两个信号是来自特定的探针葡萄球菌 。 和 S 金黄色葡萄球菌 （32.48和30.59克拉）。
图3是一种抗生素药敏试验扩增曲线代表大肠杆菌也显示，例如图2A中。每一行代表一个抗生素的细菌样本培养。低CT值的样本是在增长中存在一种抗生素，表明电阻测试抗生素发生的样本。相反，高的CT值表示在没有增长，因为抗生素，显示易感性的有效运作，以测试的抗生素发生的样本。表1说明了确定的大肠杆菌的抗菌轮廓大肠杆菌和S.金黄色葡萄球菌菌株。所有CT值报告，并使用在协议文本中提到的公式（7.1），两个截止Ct值计算lated区分性和易感性。该菌株是耐抗生素，如果报告的CT值比计算截止Ct值（反之亦然）。
图1。使用实时16S rDNA的PCR技术的病原鉴定和药敏试验程序流程图。
图2鉴别法：血培养阳性扩增曲线和循环阈值（Ct值）由通用16S rDNA探针检测，而特异性探针因果病原体的鉴定。 A.血培养扩增曲线包含大肠杆菌大肠杆菌 ; B.血培养扩增曲线， 包含 S 金黄色葡萄球菌 ; Pseu AE，Pseudomon为绿脓杆菌; UNI，16S通用探针;大肠杆菌中， 大肠杆菌探头; Pseu SP， 假单胞菌 。探头; S.肺炎， 肺炎链球菌探头，链球菌属， 链球菌属。探头;肠杆菌， 肠球菌 。探头;金黄色葡萄球菌， 金黄色葡萄球菌探头;金黄色葡萄球菌属， 葡萄球菌属。探头。
图3扩增曲线的大肠杆菌药敏试验。 大肠杆菌分离 （样品1）。每条曲线代表该菌株培养的一种抗生素。一个早期信号，这意味着该菌株生长在测试抗生素存在，因此对抗生素耐药细菌高负荷引起的。后期的信号表明，该菌株已不存在抗生素生长，换句话说，很容易。
| 示例1：E大肠杆菌 | 示例2：S金黄色葡萄球菌 | ||||
| 助攻 | CT | R / S分析 | 助攻 | CT | R / S分析 |
| 阿莫西林8毫克/升 | 16,83 | ŕ | 阿莫西林0.25毫克/升 | 21,03 | ŕ |
| 阿莫西林 - 克拉维8/4毫克/升 | 17,36 | ŕ | 苯唑2毫克/升 | 25,80 | 小号 |
| 哌拉西林16毫克/升 | 16,67 | ŕ | 万古霉素2毫克/升 | 25,20 | 小号 |
| 哌拉西林他唑巴坦16 /4毫克/升 | 24,15 | 小号 | 庆大霉素4毫克/升 | 25,86 | 小号 |
| 环丙沙星1毫克/升 | 29,72 | 小号 | 复方新诺明2/38毫克/升 | 24,62 | 小号 |
| 头孢他啶1毫克/升 | 24,03 | 小号 | |||
| 头孢他啶8毫克/升 | 26,58 | 小号 | |||
| 庆大霉素4毫克/升 | 29,83 | 小号 | |||
| 复方新诺明2/38毫克/升 | 27,60 | 小号 | |||
| 负增长的控制（抗生素的混合物） | 30,41 | 负增长的控制（样品保存于4°C） | 27,42 | ||
| 正增长控制 | 16,90 | 正增长控制 | 20,22 | ||
| 切断CT值1 * | 21,76 | 截止CT值1 *** | 23,82 | ||
| 切断CT值2 ** | 18,75 | 停产关闭CT值2 **** | 22,02 | ||
| *阿莫西林，阿莫西林 - 克拉维酸，环丙沙星，gentamic复方新诺明 **哌拉西林，哌拉西林他唑巴坦，头孢他啶 | 万古霉素，庆大霉素*** ****对阿莫西林，苯唑西林和复方新诺明 |
表1。药敏试验的两个样本 （ 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 ）的测定 。的PCR检测CT值被复制到这个Excel文件，因为它可以自动计算出从正面和负面的生长控制的两个截止CT alues，使用在协议文本中的公式。如果抗生素比截止Ct值低的CT值，应变是耐抗生素，如果Ct值高于截止，应变是容易的。
Discussion
这里描述的协议，使病原体的快速识别，并提供了一个功能抗菌的个人资料，可能会导致早期使用适当的抗生素，从而提高了患者的血液感染的预后。根据测试所要求的条件，即低成本，高吞吐量，最小的周转时间，测试条件下可以进行调整。整个过程可以在一个工作日内完成。此外，该协议的两个部分，可以同时进行，从而降低了周转时间显着。这里介绍，识别面板是一个在我们医院的临床相关细菌的选择。由于主要原理是针对16S基因区域，可以设计和其他微生物的特异性探针，加入检测。完整的检测最初用于快速分析的血培养，但也可以使用O处理进一步样品材料。这也是为药敏试验使用抗生素的情况下，可以添加更多或其他抗生素，根据当地的耐药模式和准则。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持的的AZM Profileringsfonds（PF245）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
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