Summary
העיצוב של התוכנית של יום אחד פשוט העבודה עבור אבחון פתוגן חיידקי מאפשרת זיהוי מהיר של זיהומים בדם. הכללת שמונה מטרות חיידקים רלוונטיות קלינית ופרופילים אנטיביוטיות ההתנגדות שלהם מציע תובנה המטפל הראשוני באותו יום, מה שעלול להוביל טיפול הולם יותר.
Abstract
זיהומים בדם קשורות עם שיעורי תמותה גבוהים עקב גילוי סביר של אלח דם, אלח דם חמור הלם ספטי 1. לכן, הממשל מהירה של טיפול אנטיביוטי הולם הוא בעל חשיבות ובראשונה לטיפול בזיהומים בדם. אלמנט קריטי בתהליך זה הוא העיתוי, תלויה במידה רבה את התוצאות של זיהוי חיידקים בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה. שני פרמטרים אלה מתקבלים באופן שוטף על ידי בדיקה תרבות מבוססת, וזה זמן רב לוקח על 24-48 שעות בממוצע 2, 4. מטרת המחקר הייתה לפתח את ה-DNA על בסיס מבחני לזיהוי מהיר של זיהום בדם, כמו גם הרגישות מהירה בדיקה מיקרוביאלית. Assay הראשון הוא 16S eubacterial rDNA מבוסס בזמן אמת assay PCR השלמה עם המין או הסוג הספציפי בדיקות 5. באמצעות בדיקות אלה, חיידקים גראם שליליים, כולל Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaו Escherichia coli וכן חיידקים גראם חיוביים כולל Staphylococcus spp., סטפילוקוקוס אוראוס, אנטרוקוקוס spp., סטרפטוקוקוס spp., ו Streptococcus pneumoniae ניתן היה להבחין. שימוש assay multiprobe, זיהוי הראשונה של מיקרו אורגניזם סיבתי ניתנה לאחר 2 שעות.
שנית, פיתחנו assay למחצה מולקולרית לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של ש ' aureus, אנטרוקוקוס spp. ו (פקולטטיבי) aerobe גראם שליליים מוטות 6. Assay זו התבססה על מחקר שבו PCR נעשה שימוש כדי למדוד את התפתחותם של חיידקים 7. חיידקים שנקטפו ישירות תרבויות דם מודגרת במשך 6 שעות עם מבחר של אנטיביוטיקה, ובעקבות Sybr הירוק מבוסס בזמן אמת assay PCR קובע עיכוב הצמיחה. השילוב של שתי השיטות יכול לכוון את הבחירה של טיפול אנטיביוטי מתאים באותו יום (איור 1). לסיכום, ניתוח מולקולרי של הזדהות ושל רגישות לאנטיביוטיקה מציע אלטרנטיבה מהירה יותר לזיהוי הפתוגן יכול לשפר את האבחנה של זיהומים בדם.
Protocol
חלק ראשון: זיהוי פתוגן
1. לדוגמא הכנת
הערה: העבודה המולקולרי כולו מתואר בפרוטוקול הבא יש לבצע על פי המלצות אבטחת איכות אבחון מולקולרי 3.
- הוסף aliquot 0.1 מ"ל של תרבית דם ל 0.9 מ"ל 0.9% NaCl לתוך צינור 1.5 התגובה מ"ל להיות מדגם מדוללת 1:10. (לדלל כדי למנוע עיכוב QPCR).
- סרכזת מדגם ב XG 13400 5 דקות כדי גלולה DNA חיידקי.
- Resuspend גלולה החיידקים 100 μl סטרילית מזוקקים H 2 O.
- לאחסן את דגימת DNA על השימוש ° C עד 4 יותר.
2. Assay זיהוי: בזמן אמת 16-rDNA ה-PCR
- להכין את תערובת התגובה כדלקמן. Assay מורכבת מארבעה תגובות נפרדות לדגימה. התערובת כוללת שני 12.50 μlתערובת, 0.9 מיקרומטר קדימה פריימר (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0.6 מיקרומטר צבע יסוד הפוכה (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 ו פאנל של בדיקות. הסכום של בדיקות ניתנת לכל אחד מארבעת תגובות נפרדות להלן.
- התגובה הראשונה כוללת:
- 0.2 בדיקה אוניברסלית מיקרומטר (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0.2 מיקרומטר פ aeruginosa בדיקה (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- התגובה השנייה כוללת:
- 0.2 מיקרומטר א ' בדיקה coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0.2 מיקרומטר Pseudomonas spp. בדיקה (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- תגובה 3 כוללת:
- 0.2 מיקרומטר Staphylococcus spp. בדיקה (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0.2 מיקרומטר ס בדיקה aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0.2 מיקרומטר אנטרוקוקוס spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- תגובה 4 כולל:
- 0.2 בדיקה אוניברסלית מיקרומטר (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0.3 מיקרומטר סטרפטוקוקוס spp. בדיקה (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0.2 מיקרומטר ס דלקת ריאות בדיקה (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- הוסף סטרילית מזוקקים H 2 O להגיע בנפח כולל של 20 μl. הוסף 20 μl של תערובת כל תגובה הבארות של הצלחת ה-PCR 96-היטב.
- הוסף 5 μl של הדגימה היטב כל אחד מהם.
- השתמש בסרט הדבקה כדי לאטום את הצלחת גם 96-PCR.
- הפעל את הצלחת על 7900HT PRISM ABI מערכת בזמן אמת באמצעות PCR התנאים הבאים אופטימליים רכיבה תרמית:
- טרום חימום על 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
- Denaturation ראשוני על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות
- 42 מחזורים של
- Denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות
- חישול על 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1
3. ניתוח של התוצאות
התאם את סף ניתוח ה-CT כדי 0.1 בהגדרות ניתוח טאב. צמצם את התצורות הבסיסיות להתחיל (מחזור): 6 ו End (מחזור): 15.
- רשום את סף המחזור (CT) ערך עבור כל הדגימות. ערך חתך לשקול תוצאה PCR חיובי ניתן להגדיר ערך-CT של 35. כמות החיידקים הנמצאים תרבויות דם נע בין 10 יולי - 10 נובמבר CFU / ml, ה-CT ליצור ערכי מתחת ל -35.
חלק ב: בדיקות רגישות אנטיביוטי
4. בידוד של חיידקים מתרבויות דם חיוביות 9
- Aspirate 5 מ"ל של מרק מן הבקבוק דם חיובית התרבות ולהעביר אותו לתוך צינור מפריד בסרום.
- בצנטריפוגה צינור מפריד סרום XG ב 2000 ל 10 דקות.
- מחק supernatant מהצינור מפריד בסרום.
- העברת BACteria של שכבת ג'ל של הצינור עם מטלית כותנה סטרילי לתוך מי מלח 0.9% עד 0.5 ההשעיה מק 'פרלנד רגיל מתקבל.
5. חיסון של צלחות מיקרו Titre
- לדלל את ההשעיה 0.5 מק 'פרלנד ב כפול מרוכז מילר Hinton II מרק להקים ההשעיה של 5 X 10 5 CFU / ml.
- להוסיף את ההשעיה על בארות צלחת titre מיקרו המכיל מבחר של אנטיביוטיקה (טבלה 1).
- דגירה צלחת titre מיקרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
- אחסן aliquot של השעיה על 4 מעלות צלזיוס (כמו בקרת צמיחה שלילית).
- לאחר 6 שעות של דגירה, להעביר את התוכן של כל אחד גם לתוך צינור סטרילי, כמו גם בקרת צמיחה שלילית מדגם שהיה מאוחסן ב 4 ° C.
- בצנטריפוגה צינורות ב XG 16000 דקות 5.
- מוציאים בזהירות את supernatant, מבלי להפריע גלולה חיידקי.
- Resuspend גלולה ב H מזוקקים סטרילית
- לדלל את הדגימות 10 של פי סטרילית מזוקקים H 2 O.
6. בזמן אמת 16-rDNA ה-PCR 10
- מכינים את תערובת PCR כדלקמן:
- 12.50 μl iQ SYBR גרין Supermix
- 0.5 מיקרומטר קדימה תחל 16S-1 (5 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0.25 מיקרומטר פריימר 16S-2 הפוך (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- סטרילית מזוקקים H 2 O ל בהיקף כולל של 20 μl
- הוסף 20 μl של תערובת PCR על בארות צלחת PCR 96-היטב.
- הוסף 5 μl של הדגימה היטב כל אחד מהם.
- השתמש בסרט הדבקה כדי לאטום את הצלחת גם 96-PCR.
- הפעל את הצלחת על מערכת אחת, צבע MyiQ PCR בזמן אמת איתור, באמצעות התנאים הבאים אופטימליים רכיבה תרמית:
- Denaturation ראשוני על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות
- ראשוני חישול ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
- 35 מחזורים של
- Denaturation ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות
- חישול על 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1
- ממיסים ניתוח עקומת (60-95 מעלות צלזיוס ב 20 דקות עם במרווחים של 0.57 ° C)
7. ניתוח של התוצאות
- לחשב את ערך חתך Ct באחת הנוסחאות הבאות (בהתאם לסוג של אנטיביוטיקה).
- באופן כללי:
ניתוק Ct ערך = ct צמיחה חיובית ערך Control + 0.5 x (CT צמיחה שלילית ערך השליטה - Ct שליטה חיובית ערך גידול) - Piperacillin, piperacillin / tazobactam ו ceftazidime ב גראם שליליים, מוטות, אמוקסיצילין, oxacillin ו trimethoprim / sulfamethoxazole ב S.aureus: אמוקסיצילין ב אנטרוקוקוס spp. Cut-off Ct ערך = ct צמיחה חיובית ערך Control + 0.25 x (צמיחה Ct ערך שלילי בקרה - בקרה חיובית Ct ערך גידול)
- באופן כללי:
- השתמש במדגם מודגרות עם סטרילית מזוקקים H 2 O כמו בקרת צמיחה חיובית.
- בהתאם מיקרואורגניזם, להשתמש בשלט המתאים צמיחה שלילית:
- גראם שלילי לדוגמא מוטות מודגרות בתערובת של אנטיביוטיקה
- אנטרוקוקוס spp. לדוגמה לאחסן על 4 מעלות צלזיוס
- לדוגמא S.aureus מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס
- לקבוע את הרגישות (S) או התנגדות (R) של המתח על אנטיביוטיקה נבדק באופן הבא:
- Ct ערך גבוה מערך ה-CT חתוכים עולה הרגישות
- Ct ערך נמוך יותר מאשר ערך ה-CT חתוכים מציין התנגדות
8. נציג תוצאות
שני אורגניזמים מודל, כלומר גראם שלילי א coli ו גראם חיובי ס aureus, נבחרו כדי להמחיש את התהליך המשולב לגילוי וזיהוי של חיידקים פתוגנים וקביעת פרופיל מיקרוביאלית שלהם. חלקו הראשון של פרוטוקול כולל זיהוי הפתוגן. SPE בדיקות cific נועדו לצורך זיהוי של שמונה מיקרואורגניזמים רלוונטיות קלינית. במעמד של יעד כלל בלוח חיידקי, עקומות הגברה נוצרים ערכים מחושבים ה-CT (איור 2). ערך חתך לשקול תוצאה PCR חיובי מוגדר הערך CT של 35. איור 2 א, פרופיל זיהוי של תרבות E.coli-נגוע הדם מוצג. בדיקה 16S אוניברסלית כלול שני תערובות התגובה נפרדות וכתוצאה מכך יוצרת שתי עקומות הגברה (CT של 25.20 ו 25.95). האות השלישית נגזרת ספציפית בדיקה עבור ה coli (CT של 27.04). זיהוי של ס ' aureus, נגוע בתרבות הדם מוצג באיור 2 ב. בדיקה 16S אוניברסלית יש אותות הגברה של 33.35 ו - 33.71. שני האותות הנותרים נגזרות בדיקות ספציפיות עבור Staphylococcus spp. וס ' סטפילוקוקוס (CT של 32.48 ו 30.59).
ss => "jove_content" אחרי החלק הראשון של הפרוטוקול, מיקרואורגניזם סיבתי ידוע הפרופיל מיקרוביאלית ניתן לקבוע. איור 3 הוא דוגמה העלילה הגברה בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה, המייצג את המתח E.coli שהוקרן גם ב איור 2 א. כל שורה מייצגת 1 אנטיביוטי כי המדגם חיידקי הודגר עם. לדוגמה עם ערך נמוך Ct דוגמה שבה הצמיחה התרחשה בנוכחות התנגדות, אנטיביוטיקה המציין לאנטיביוטיקה נבדק. להיפך, ערך גבוה Ct מייצג מדגם שבו הצמיחה לא חל בגלל עבודה יעילה של רגישות, המציין אנטיביוטיקה לאנטיביוטיקה נבדק. טבלה 1 מדגימה את קביעת הפרופיל מיקרוביאלית של א ' coli וס ' aureus מבודד. כל ערכי ה-CT מדווחות, באמצעות הנוסחאות שהוזכרו בטקסט Protocol (7.1), שני חתוכים ערכי ה-CT הם calculated להבחין בין התנגדות הרגישות. זן עמיד לאנטיביוטיקה אם הערך דיווח CT הוא נמוך יותר מאשר ערך מחושב Ct חתוכים (ולהיפך).
1. תרשים זרימה תרשים של זיהוי הפתוגן הליך בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות בזמן אמת 16S rDNA PCR.
איור 2 assay זיהוי:. מגרשים הגברה סף מחזור וערכים (ערכי ה-CT) תרבית דם חיובית הוא זוהה על ידי 16S rDNA בדיקה אוניברסלית, ואילו בדיקות מסוימות משמשים לזיהוי של הפתוגן סיבתי.. עלילה א 'הגברה של תרבית דם המכיל א coli, העלילה ב 'הגברה של תרבית דם המכיל ס aureus, Pseu AE, Pseudomonכמו aeruginosa, חד, 16S בדיקה אוניברסלית; Ecoli, Escherichia coli בדיקה; Pseu SP, Pseudomonas spp. בדיקה: ס pneu, Streptococcus pneumoniae בדיקה, דלקת SP, סטרפטוקוקוס spp. בדיקה: Entero, אנטרוקוקוס spp. בדיקה: ס aureus, Staphylococcus aureus בדיקה; Staph SP, Staphylococcus spp. בדיקה.
3. איור הגברה העלילה של בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה של א ' coli לבודד (לדוגמה 1). העקומה מייצגת 1 אנטיביוטי כי זן הודגר עם. איתות מוקדם נגרמת על ידי עומס חיידקי גבוה, כלומר, המתח גדל בנוכחות אנטיביוטיקה נבדק והוא עמיד ובכך אנטיביוטי. אותות המאוחרות עולה כי המתח לא גדלה בנוכחות אנטיביוטיקה, במילים אחרות, הוא רגיש.
| דוגמה 1: א ' coli | דוגמה 2: ס aureus | ||||
| AST | CT | R / S | AST | CT | R / S |
| אמוקסיצילין 8 מ"ג / ל ' | 16,83 | R | אמוקסיצילין 0.25 מ"ג / ל ' | 21,03 | R |
| Amoxicillin-clavulanate 8/4 מ"ג / ל ' | 17,36 | R | Oxacillin 2 מ"ג / ל ' | 25,80 | S |
| Piperacillin 16 מ"ג / ל ' | 16,67 | R | Vancomycin 2 מ"ג / ל ' | 25,20 | S |
| Piperacillin-tazobactam 16 /4 מ"ג / ל ' | 24,15 | S | גנטמיצין 4 מ"ג / ל ' | 25,86 | S |
| ציפרופלוקסאצין 1 מ"ג / ל ' | 29,72 | S | Trimethoprim-sulfamethoxazole 2/38 מ"ג / ל ' | 24,62 | S |
| Ceftazidime 1 מ"ג / ל ' | 24,03 | S | |||
| Ceftazidime 8 מ"ג / ל ' | 26,58 | S | |||
| גנטמיצין 4 מ"ג / ל ' | 29,83 | S | |||
| Trimethoprim-sulfamethoxazole 2/38 מ"ג / ל ' | 27,60 | S | |||
| צמיחה שלילית השליטה (תערובת של אנטיביוטיקה) | 30,41 | צמיחה שלילית השליטה (לדוגמה לאחסן על 4 מעלות צלזיוס) | 27,42 | ||
| צמיחה חיובית השליטה | 16,90 | צמיחה חיובית השליטה | 20,22 | ||
| חתוכים CT-ערך 1 * | 21,76 | חתך CT-הערך 1 *** | 23,82 | ||
| חתוכים CT-הערך 2 ** | 18,75 | חתך CT-הערך 2 **** | 22,02 | ||
| * לקבלת אמוקסיצילין, amoxicillin-clavulanate, ציפרופלוקסאצין, gentamicב, trimethoprim-sulfamethoxazole עבור ** piperacillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidime | עבור *** vancomycin ו גנטמיצין **** עבור אמוקסיצילין, oxacillin ו trimethoprim-sulfamethoxazole |
טבלה 1. קביעת בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה של שתי דגימות (E.coli ו S.aureus). ערכי ה-CT של PCR-assay הועתקו לקובץ Excel זו, כפי שניתן מחשב באופן אוטומטי את שני חתוכים alues ה-CT משליטת צמיחה חיובית או שלילית, תוך שימוש בנוסחאות שמוצגות הטקסט פרוטוקול. אם אנטיביוטיקה מראה Ct ערך נמוך יותר משווי ה-CT חתוכים, זן עמיד לאנטיביוטיקה, אם הערך Ct היה גבוה יותר מאשר ניתוק, זן רגיש.
Discussion
פרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר של פתוגנים ומספק פרופיל מיקרוביאלית תפקודית שעלולה להוביל הממשל מוקדם של אנטיביוטיקה הולמים ובכך לשפר את הפרוגנוזה של חולים עם זיהומים בדם. בהתאם לתנאי המבוקשים של הבדיקה, כלומר עלות נמוכה, תפוקה גבוהה, להפוך מינימלית, בערך באותה תקופה, תנאי הבדיקה ניתן להתאים. ההליך כולו יכול להתבצע תוך יום עבודה אחד. יתר על כן, שני חלקים של פרוטוקול יכול להתבצע בעת ובעונה אחת, אשר מפחיתה את זמן סיבוב סביב באופן משמעותי. כפי שהוצגו כאן, את לוח הזיהוי מבחר של חיידקים ביותר רלוונטיות קלינית בבית החולים שלנו. מאז העיקרון המרכזי הוא מיקוד באזור 16S גנטי, בדיקות ספציפיות מיקרואורגניזמים אחרים יכול להיות מעוצב נוסף assay. Assay מלאה נועדה במקור לצורך ניתוח מהיר של תרבויות דם, אבל יכול לשמש גם לעיבוד של oיס חומרים לדוגמה. זהו גם המקרה של אנטיביוטיקה, אשר שימשו לצורך בדיקות רגישות אנטיביוטיקה: אנטיביוטיקה יותר או אחר ניתן להוסיף, בהתבסס על דפוסי התנגדות וקווים מנחים מקומיים.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי עזם Profileringsfonds (PF245).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257 (2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).
