Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

Summary

Qui forniamo un protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto in presenza di uno strato alimentatore gliali. I neuroni coltivati ​​stabilire la polarità e di creare le sinapsi, e può essere separato dalla glia per l'utilizzo in diverse applicazioni, quali elettrofisiologia, imaging del calcio, saggi di sopravvivenza cellulare, immunocitochimica, e RNA / DNA / isolamento delle proteine.

Abstract

Questo video vi guiderà attraverso il processo di neuroni corticali di ratto coltura in presenza di uno strato alimentatore gliali, un sistema noto come bilaminar o co-coltura modello. Questo sistema è adatto per una varietà di esigenze sperimentali che richiedono sia un substrato di vetro o di plastica e la crescita può essere utilizzato anche per la cultura di altri tipi di neuroni.

Neuroni corticali di ratto ottenuto dalla fase tardo embrionale (E17) sono placcati in coprioggetto di vetro o piatti coltura di tessuti di fronte a un alimentatore strato di cellule gliali cresciuti su piatti o lamelle di plastica (noto come Thermanox), rispettivamente. La scelta tra le due configurazioni dipende dalla specifica tecnica sperimentale utilizzata, che può richiedere, o meno, che i neuroni sono cresciuti su vetro (es. calcio di imaging contro Western Blot). Lo strato alimentatore gliali, un astroglia arricchito la cultura secondaria di cellule gliali misti, è separata preparata dalla corteccia di cuccioli di ratto appena nati (P2-4) prima della neuronaledissezione.

Uno dei principali vantaggi di questo sistema di coltura rispetto ad una cultura di neuroni è solo il sostegno della crescita neuronale, la sopravvivenza e la differenziazione forniti da fattori trofici secreto dallo strato alimentatore gliali, che assomiglia più accuratamente l'ambiente cervello in vivo. Inoltre, il co-cultura può essere utilizzato per studiare le interazioni neuroni-glia ^1.

Allo stesso tempo, la contaminazione glia nello strato neuronale è impedita da diversi mezzi (cultura bassa densità, l'aggiunta di inibitori della mitosi, la mancanza di siero e di uso di mezzo di coltura ottimizzato) che porta a un livello praticamente puro neuronale, paragonabile ad altre modalità stabilite ^{1 -3.} I neuroni possono essere facilmente separato dallo strato gliale in qualsiasi momento durante cultura e utilizzati per diverse applicazioni sperimentali che vanno dal ⁴ elettrofisiologia, biologia cellulare e molecolare ^5-8, biochimica ^5, imaging e microfonoroscopy ^4,6,7,9,10. I neuroni primari estendere assoni e dendriti di formare sinapsi funzionali ^11, un processo che non si osserva in linee cellulari neuronali, anche se alcune linee cellulari si estendono i processi.

Un protocollo dettagliato dei neuroni dell'ippocampo di ratto coltura utilizzando questo sistema di co-coltura è stato descritto in precedenza ^4,12,13. Qui dettaglio un protocollo modificato adatto per i neuroni corticali. Come circa 20x10 ⁶ celle vengono recuperati da ogni embrione di ratto, questo metodo è particolarmente utile per gli esperimenti che richiedono un gran numero di neuroni (ma non preoccupati per una popolazione altamente omogenea neuronale). La preparazione dei neuroni e glia deve essere pianificato in un tempo specifico modo. Vi forniremo il passo-passo protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto e coltura delle cellule gliali di supporto ai neuroni.

Protocol

1. Glia Dissection (~ 2 settimane prima neuroni placcatura)

1. Per preparare gli strumenti per collocare la dissezione sterile in etanolo al 70%, aggiungere 4 ml di media dissezione a freddo a 60 piatti mm (un piatto per ogni cervello), e il luogo del 2,5% tripsina e DNasi sul ghiaccio per scongelare (vedi i dettagli sugli strumenti chirurgici nella tabella VI ).
2. Usare le forbici grandi di decapitare 2-4 cuccioli giorno di vita e le teste posto in un piatto da 100 millimetri sterile.
3. Usare le forbici di media per fare un taglio della linea mediana attraverso la pelle e tirare indietro la pelle per esporre il cranio. Usare le forbici curve per fare un taglio sulla linea mediana e due tagli laterali attraverso il cranio, senza danneggiare il tessuto cerebrale sottostante. Rimuovere la parte superiore del cranio per esporre il cervello.
4. Estrarre il cervello e metterlo nella propria parabola di 60 mm contenente 4 medie dissezione a freddo ml (vedi tabella I per composizione). Porre la capsula sotto uno stereomicroscopio (Leica ZOOM 2000, il controllo dello zoom: 70-30) e utilizzare pinze No.5 per separare gli emisferi, rimuovere il mesencefalo, e la buccia off le meningi.
5. Raccogliere tutte le cortecce cerebrali sezionato in un fresco piatto 60 mm con medio dissezione a freddo, e tritare il tessuto con le forbici curve.
6. Trasferire il tessuto tritato ad una sterile tubo 15 ml. Portare il volume a 4,5 ml con media dissezione a freddo e aggiungere 500 ml di 2,5% tripsina. Avvolgere il tubo in Parafilm e galleggiare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 minuti, mescolando di inversione ogni 5 minuti.

   (Nota: qui si descrive il protocollo che generalmente seguite quando si utilizza fino a 5 cervello, se più piccoli vengono utilizzati, volumi potrebbe essere necessario regolare opportunamente)

7. Trasferire il tessuto di un nuovo tubo di 15 ml, riducendo al minimo il volume della tripsina mezzo contenente dissezione riportati. Portare il volume a 4.8mL di medio dissezione fresco e aggiungere 200 microlitri DNasi per raggiungere una concentrazione finale di 60 ug / mL (soluzione madre: 3 mg di DNase e 5 mg MgSO4 in 2 ml di terreno dissezione). Triturare delicatamente ~ 20 volte con una pipetta sterile 5 mLte, poi aggiungere 10 ml di medium glia placcatura (vedi tabella II per la composizione).
8. Permettono grossi pezzi di tessuto di stabilirsi per 4-5 minuti, quindi trasferire il 80% superiore della sospensione di cellule in una provetta da 50 mL. Ripetere la triturazione dei tessuti con un ulteriore 2-3 mL di medium glia placcatura (e usando una pipetta più piccolo se necessario), di nuovo, permettere al tessuto di stabilirsi, e aggiungere il 80% superiore alla collezione precedente. Portare il volume complessivo di 20 ml di medio glia placcatura e centrifugare per 15 minuti a 280 g (o 1300 giri al minuto in una centrifuga IEC Centra CL2).
9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media glia placcatura (circa 5-7 mL utilizzando a seconda del numero di cuccioli utilizzati), quindi aggiungere ulteriore supporto di placcatura in modo da avere 10 ml per ogni cervello sezionato. Mescolare bene e tavola 10 ml di sospensione di cellule in ogni cm 75 ² pallone (cioè un cervello per bombola).
10. Spostare fiaschi cultura in un incubatore a 37 ° C (5 a 10% di CO2; proporzionale alla bicarbona sodiote contenuto del mezzo). Cambiare terreno di coltura dopo 24-48 ore, poi ogni 3-4 giorni.

2. Glia secondaria (48 ore prima neuroni placcatura)

1. Preparare thermanox coprioggetti (se i neuroni sono placcati su piatti) con l'aggiunta di 3 gocce di cera fusa paraplast intorno alla circonferenza di ogni thermanox lavati e sterilizzati in autoclave. Cellule saranno placcato su questo lato della thermanox. Il nostro thermanox sono fatti a mano riutilizzabili ~ 60 inserti da taglio mm in plastica (vedi tabella VI di reagenti) con ~ 50 2 mm fori praticati attraverso, anche se la cultura disponibili in commercio anche inserti, possono essere usati.
2. Lavare la glia primario con PBS due volte, scuotendo vigorosamente ogni pallone per rimuovere tutte le cellule senza legami. Ogni pallone con confluenti glia primario forniranno circa 10 milioni di astroglia, quindi si utilizzano regolarmente 2-4 palloni per esperimento.
3. Staccare le cellule con il 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% tripsina-EDTA soluzione madre diluita in 9 ml di PBS). Combine le cellule da 2 flaconi in un tubo da 50 ml e aggiungere una quantità equivalente di mezzo glia placcatura (vedi tabella II di reagenti). Centrifugare per 15 minuti a 280 g. Aspirare il supernatante e sciogliere la glia pellet in pochi ml di medium glia placcatura.
4. Contare le celle utilizzando un hematocytometer e diluire la sospensione cellulare in base alle esigenze (~ 1x10 ⁶ cellule / ml); piatto le cellule, sia su 60 millimetri piatti (se i neuroni sono placcati in lamelle), o sul coprioggetto thermanox (se i neuroni sono placcati in 60 piatti mm). Le cellule devono essere placcato a 500.000 cellule per piatto o thermanox con placcatura medio glia. Nel caso di thermanox coprioggetto, piatto 600 ml di cellule in maniera goccia a goccia, poi dopo 2 ore thermanox a fogli mobili e cellule gliali immergere nel medio placcatura.
5. Se la preparazione di 60 piatti mm glia secondario per coprioggetto neuronale, il cambiamento medio N2.1 la sera prima della dissezione neuronale.

3. Dissezione neuronalee Cultura

1. Preparare coprioggetto di vetro (15 mm di diametro) con l'aggiunta di 3 gocce di cera fusa paraplast intorno alla circonferenza di ogni coprioggetto sterili, al fine di separare fisicamente i strati di cellule e di prevenire la raschiatura delle cellule. Cellule saranno placcato su questo lato del coprioggetto.
2. Piastre cappotto o coprioggetto con 0,5 mg / ml polilisina (sia poli-L-lisina o poli-D-lisina sciolto in tampone borato, vedi tabella VI) per 2 ore o durante la notte. Lavare con acqua sterile 2-3 volte e lasciare asciugare completamente. Nota: coprioggetto sono posti in una capsula di Petri idrofobico per evitare fuoriuscite / diffusione delle soluzioni durante il rivestimento con placcatura poli-lisina o cellula, che può facilmente verificarsi se il coprioggetto sono posti in piastre di coltura dei tessuti.
3. Preparati per la dissezione neuronali come per la dissezione glia (passo 1.1). Euthanize un 17-giorni di ratto gravide, spruzzare il pelo con il 70% di etanolo, e tagliare medialmente attraverso la pelle per esporre l'utero. Rimuovere tutti i feti e metterli in unsterile 100 millimetri piatto.
4. Rapidamente sezionare libero e decapitare ogni feto, ponendo ogni testa nella propria parabola di 60 mm con medio dissezione a freddo (4 ml). Noi normalmente sezionare feti 4-5 per sperimentare come circa 20 milioni di neuroni sono derivati ​​da ogni feto E17. Se più embrioni sono necessari, assicurarsi che l'intera procedura (da punto 3.4 a 3.12) non dura più di 9-10 minuti.
5. Utilizzando uno stereomicroscopio e No.1/No.5 pinze isolare la corteccia cerebrale tirando aprire la pelle e il cranio, l'estrazione del cervello, che separa gli emisferi, e la rimozione del mesencefalo e meningi.
6. Raccogli tutte le cortecce sezionato in un fresco piatto 60 mm con medio dissezione a freddo, e tritare il tessuto con le forbici curve in ~ 1 pezzi mm.
7. Trasferire il tessuto tritato ad una sterile tubo 15 ml. Portare il volume a 4,5 ml con media dissezione a freddo e aggiungere 500 ml di 2,5% tripsina. Avvolgere il tubo in Parafilm e galleggiare in un bagno d'acqua ° 36 C per 15 minutes, la miscelazione per inversione ogni 5 minuti.
8. Trasferire il tessuto di un nuovo tubo di 15 ml, riducendo al minimo il volume della tripsina mezzo contenente dissezione riportati. Portare a 4,8 ml di medio dissezione fresco e aggiungere 200 microlitri DNasi per raggiungere una concentrazione finale di 60 ug / ml. Triturare circa 10 volte con una sterile 5 o 2 pipetta ml; ripetere questo passaggio, se necessario utilizzando un fuoco lucido (a freddo) pipetta Pasteur di dissociare la maggior parte del tessuto. Allora che pezzi rimanenti di tessuto (in genere molto pochi, se del caso) di stabilirsi per 4-5 minuti.
9. Rimuovere la parte superiore a cella singola sospensione, lasciando alle spalle pezzi di tessuto si stabilirono, e posto questa soluzione in un tubo nuovo con un volume equivalente di mezzo di rivestimento dei neuroni (vedi tabella III). Mescolare bene ma con delicatezza, poi contare le cellule; piatto il 15 coprioggetto millimetri (35.000 cellule ciascuna in 200 mL) o 60 piatti mm (1x10 ⁶ celle ciascuno in 3 ml), se necessario. Trasferire le cellule al incubatore (36,5 ° C, 5-10% di CO2).
10. Dopo 3-4 ore combine lo strato di neuroni e la glia secondaria come segue. Per i neuroni su 60 piatti mm, lavare le cellule con DMEM caldo, cambiare il mezzo per 4 ml di siero di media libero (N2, vedi tabella IV), e aggiungere un thermanox con glia per ogni piastra (cellule gliali deve essere rivolto verso i neuroni). Per coprioggetto neuronale, il trasferimento 3-5 vetrini per ogni piatto 60 mm di glia secondaria, con i neuroni verso il basso.
11. 24 ore dopo la placcatura dei neuroni, aggiungere 10 mM di citosina-β-D-arabinofuranoside ad ogni piatto, al fine di prevenire la proliferazione cellule gliali. Prepariamo quattro soluzioni di riserva mM, diluire 1:10 con media N2, e aggiungere 25 UL / mL di soluzione diluita di ogni piatto.
12. Le cellule sono generalmente utilizzati per esperimenti, dopo 7-10 giorni di cultura, anche se ora esatta dipende dallo stadio di differenziazione desiderata, ma sono state coltivate per un massimo di 4 settimane senza una riduzione significativa della sopravvivenza. Dopo la prima settimana, si raccomanda che la metà del volume dei media essere sostituiti ogni settimana.

Poche ore dopo i neuroni hanno attaccato al substrato, cominciano a estendere lamelliopodia. I processi continuano ad allungarsi (Fig. 2A) e polarizzare su più giorni di cultura, e gli assoni e dendriti estese sono chiaramente visibili (Fig. 2B; MAP2 colorazione). Come neuroni maturi i pergolati dendritiche diventano più elaborati e sviluppare i contatti sinaptici; circa 2-3 settimane dopo la placcatura molte spine dendritiche sono visibili (Fig. 2C) ^11.

Figura 1. Diagramma di flusso della procedura per la coltura di neuroni corticali di ratto con uno strato alimentatore gliali (cellule gliali secondaria). In primo luogo, 11 giorni prima della dissezione neuronale, una cultura glia primario è preparato da ratti neonati (P2-4). Quando le cellule sono confluenti (circa nove giorni dopo la placcatura glia primario e due giorni prima della dissezione neuronale), gli astrociti sono mechanically separati da cellule precursori degli oligodendrociti e microglia e placcato sia su piatti o thermanox (glia secondaria). I neuroni sono poi ottenuti dalla corteccia di embrioni E17 e placcato sia su vetrini o sui piatti (rivestito con poli-lisina). Quattro ore dopo la placcatura, lo strato neuronale viene aggiunto alla glia secondario.

Figura 2 Esempi di culture in varie fasi (ad esempio, 5 ore, 12 DIV, 21 DIV).. Le cifre sono immagini rappresentative dei neuroni corticali su vetrini in diversi momenti. Dopo i neuroni allegare ai neuroni substrato iniziano a estendere lamelliopodia. Contrasto di fase mostra un paio di neuriti esteso cinque ore dopo placcatura (A). L'immagine al centro (B, da Cook et al. 2010, con il permesso) mostra 12 neuroni corticali DIV fissa e immunoistochimica con il marcatore dendritiche neuronali MAP2. Colorazione Hoechst fu usato come counterstaiNing. Come neuroni maturi spine dendritiche anche diventare visibile (C). Barre di scala: A, B = 25 micron; C = 10 micron.

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo per la coltura topo neuroni corticali primarie in presenza di cellule gliali, mentre i neuroni permettendo di essere facilmente isolate per l'analisi sperimentale. Lo sviluppo di supporto gliali di un fenotipo sano neuronale, mentre le risposte neuronali modulando anche a trattamenti sperimentali in un modo fisiologicamente rilevanti. Inoltre, per passaging la glia primaria prima coltura con neuroni questa popolazione cellulare diventa selettivo arricchito in astrociti, impedendo così la stimolazione infiammatoria della microglia. Per alcuni tipi di esperimenti, tuttavia, diverse proporzioni di cellule gliali possono essere desiderato, quindi culture glia aggiuntive possono essere eseguite per ottimizzare questa composizione cellulare. Questo protocollo può anche essere adattato per i neuroni coltura derivate da altre regioni del cervello, come l'ippocampo, per soddisfare particolari esigenze di sperimentazione

Preoccupazioni principali di questa tecnica sono la prevenzione cont battericaamminazione e prevenire la proliferazione gliale nello strato neuronale. Questo sistema non include gli agenti antibiotici, quindi le tecniche sterili sono particolarmente critici in tutte le fasi. Proliferazione gliale è impedito con l'aggiunta di anti-mitotico agente arabinofuranoside citosina, la placcatura a bassa densità e il siero senza terreno di coltura; seguendo questo protocollo astrociti dovrebbero comporre non più del 3-5% delle cellule del ^1,4 strato neuronale e meno dell'1% microglia dovrebbe essere rilevata. Immunopanning o altre tecniche possono essere utilizzate per rimuovere anche questo a bassa contaminazione glia ^4.

Questa tecnica può anche essere modificato per co-coltura di una varietà di tipi di cellule aderenti, quando isolare un solo tipo di analisi è auspicabile. Per esempio, questo sistema è stato adattato con successo per analizzare gli effetti degli osteoblasti su Ca ^{2 +} segnalazione in osso-metastatico delle cellule tumorali ^14.