Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

Summary

Hier hebben we een protocol voor het kweken van rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag. De gekweekte neuronen tot stand polariteit en creëren synapsen, en kan gescheiden worden van de glia voor gebruik in diverse toepassingen, zoals electrofysiologie, calcium imaging, overleving van de cel assays, immunocytochemie, en RNA / DNA / eiwit isolatie.

Abstract

Deze video zal u begeleiden door het proces van het kweken rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag, een systeem dat bekend staat als een bilaminar of co-cultuur model. Dit systeem is geschikt voor een verscheidenheid aan experimentele behoeften die ofwel een glazen of plastic ondergrond groei en kan ook gebruikt worden voor de cultuur van andere soorten neuronen.

Rat corticale neuronen verkregen uit de late embryonale stadium (E17) zijn uitgeplaat op dekglaasjes of weefselkweek gerechten te maken met een feeder laag van glia geteeld op schotels of plastic dekglaasjes (bekend als Thermanox), respectievelijk. De keuze tussen de twee configuraties afhankelijk van de specifieke gebruikte experimentele techniek, die aanleiding kunnen geven, of niet, dat de neuronen gekweekt op glas (bv. calcium beeldvorming ten opzichte van Western blot). De gliale feeder-laag, een astroglia verrijkte secundaire cultuur van gemengde glia, wordt afzonderlijk bereid uit de cortex van pasgeboren ratten pups (P2-4) voorafgaand aan de neuronaledissectie.

Een groot voordeel van deze cultuur systeem in vergelijking met een cultuur van neuronen is alleen de steun van neuronale groei, de overleving en differentiatie door trofische factoren afgescheiden van de gliale feeder-laag, aangezien dit beter in de hersenen omgeving lijkt in vivo. Bovendien kan de co-cultuur worden gebruikt om de neuronale-gliale interacties ^een studie.

Op hetzelfde moment, is glia verontreiniging in de neuronale laag voorkomen worden door verschillende middelen (low density cultuur, toevoeging van mitotische remmers, gebrek aan serum en het gebruik van geoptimaliseerde cultuur medium) die leidt tot een vrijwel pure neuronale laag, vergelijkbaar met andere gevestigde methoden ^{een -3.} Neuronen kunnen eenvoudig worden gescheiden van de gliale laag op elk moment tijdens de cultuur-en gebruikt worden voor verschillende experimentele toepassingen, variërend van de elektrofysiologie ^4, cellulaire en moleculaire biologie ^5-8, biochemie ^5, imaging en microfoonroscopy ^4,6,7,9,10. De primaire neuronen uit te breiden axonen en dendrieten te vormen functionele synapsen ^11, een proces dat niet is waargenomen in neuronale cellijnen, hoewel sommige cellijnen niet uitstrekken processen.

Een gedetailleerd protocol van het kweken van rat hippocampale neuronen het gebruik van deze co-cultuur systeem is eerder ^4,12,13 beschreven. Hier hebben we een detail aangepast protocol geschikt is voor corticale neuronen. Aangezien ongeveer 20x10 ⁶ cellen worden gewonnen uit elke rat embryo, deze methode is vooral handig voor experimenten waarbij grote aantallen neuronen (maar niet bezorgd over een zeer homogene neuronale populatie). De voorbereiding van neuronen en gliacellen moet worden gepland in een tijd-specifieke wijze. Wij zullen de stap-voor-stap protocol voor het kweken van rat corticale neuronen en gliacellen kweken om de neuronen ondersteunen.

Protocol

1. Glia Dissection (~ 2 weken voor plating neuronen)

1. Ter voorbereiding op de dissectie plaats steriele instrumenten in 70% ethanol, voeg 4 ml koud dissectie middellange tot 60 mm gerechten (een gerecht per hersenen), en plaats 2,5% trypsine en DNase op ijs te ontdooien (zie details over chirurgische instrumenten in tabel VI ).
2. Gebruik grote schaar tot 2-4 dagen oude pups en plaats hoofden onthoofden in een 100 mm steriele schotel.
3. Gebruik medium schaar om een ​​middellijn snede te maken door de huid en trek de huid aan de schedel bloot te leggen. Gebruik gebogen schaar om een ​​middellijn knippen en twee zijdelingse snijdt door de schedel te maken, zonder schade aan het hersenweefsel eronder. Verwijder de bovenste schedel naar de hersenen bloot te leggen.
4. Pak de hersenen en plaats deze in zijn eigen 60 mm schotel met 4 ml koud dissectie medium (zie tabel I voor compositie). Zet de schaal onder een stereomicroscoop (Leica ZOOM 2000, zoomfunctie: 70-30) en gebruik No.5 tang om de hersenhelften gescheiden, verwijdert de middenhersenen, en pel off de hersenvliezen.
5. Verzamel alle ontleed cerebrale cortex in een frisse 60 mm schaal met koud dissectie medium, en gehakt het weefsel met gebogen schaar.
6. Breng de gehakte weefsel om een ​​steriele 15 ml buis. Breng het volume op 4,5 ml met koude dissectie medium en voeg 500 pi van 2,5% trypsine. Wikkel de buis in Parafilm en zweven in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten, mengen door inversie om de 5 minuten.

   (NB: hier hebben we het protocol waarin we over het algemeen volgen bij het gebruik van maximaal 5 hersenen te beschrijven; als er meer pups worden gebruikt, volumes kan het nodig zijn om adequaat te worden aangepast)

7. Overdracht van het weefsel naar een nieuw 15 ml tube, het minimaliseren van het volume van de trypsine-bevattend medium dissectie overgedragen. Breng het volume op 4.8mL met vers dissectie medium en voeg 200 ul DNase tot een uiteindelijke concentratie van 60 ug / ml (voorraad-oplossing: 3 mg van DNase en 5 mg MgSO4 in 2 ml dissectie medium) te bereiken. Vermaal voorzichtig ~ 20 keer met een steriele 5 ml pipette, voeg dan 10 ml van glia plating medium (zie tabel II voor compositie).
8. Laat grote stukken van het weefsel om zich te vestigen voor 4-5 minuten, dan is overdracht van de top 80% van de celsuspensie om een ​​50 ml buis. Herhaal het weefsel tritureren met een extra 2-3 ml van glia plating medium (en het gebruik van een kleinere pipet indien nodig), weer, laat het weefsel om zich te vestigen, en voeg de top 80% van de vorige collectie. Breng het totale volume tot 20 ml met glia plating medium en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 280 g (of 1300 rpm in een IEC Centra CL2 centrifuge).
9. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in glia plating medium (ruwweg met behulp van 5-7 ml, afhankelijk van het aantal gebruikte pups), voeg dan extra plating medium om 10 mL hebben voor ontleed elke hersenen. Meng goed en plaat 10 ml celsuspensie in elke 75 cm ² kolf (dat wil zeggen een brain per fles).
10. Verhuizen cultuur kolven om een ​​incubator ingesteld op 37 ° C (5 tot 10% CO2, evenredig met de natrium bicarbonate inhoud van het medium). Verandering kweekmedium na 24-48 uur, daarna om de 3-4 dagen.

2. Secundaire Glia (48 uur vóór plating neuronen)

1. Bereid thermanox dekglaasjes (indien van neuronen worden verzilverd op de vaat) door toevoeging van drie kleine druppels gesmolten paraplast was rond de omtrek van elke gewassen en geautoclaveerd thermanox. Cellen worden uitgeplaat op deze kant van de thermanox. Onze thermanox zijn handgemaakt herbruikbare ~ 60 mm inserts gesneden uit plastic (zie tabel VI van de reagentia), met ~ 50 mm twee gaten geboord door, hoewel de handel verkrijgbare cultuur en inserts kunnen in plaats daarvan worden gebruikt.
2. Was de primaire glia met PBS twee keer, krachtig schudden elke kolf aan een losse cellen te verwijderen. Elke kolf met samenvloeiing primaire glia zal zowat 10 miljoen astroglia, daarom hebben we regelmatig gebruik van 2-4 flesjes per experiment.
3. Maak de cellen met 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% trypsine-EDTA voorraad-oplossing verdund in 9 ml PBS). Combine van de cellen van twee flesjes over in een 50 ml conische buis en voeg een gelijke hoeveelheid van glia plating medium (zie tabel II van de reagentia). Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 280 g. Zuig het supernatant en los de glia pellet in een paar ml van glia plating medium.
4. Tel de cellen met behulp van een hematocytometer en verdun de celsuspensie als nodig (~ 1x10 ⁶ cellen / ml), het bord van de cellen, hetzij op 60mm schotels (als neuronen wordt uitgeplaat op dekglaasjes) of op thermanox dekglaasjes (als neuronen wordt uitgeplaat op 60 mm gerechten). De cellen moeten worden uitgeplaat op 500.000 cellen per schotel of thermanox met behulp van glia plating medium. In het geval van thermanox dekglaasjes, plaat 600 ul van cellen in een druppelsgewijze mode, dan na 2 uur flip thermanox en dompel cellen in glia plating medium.
5. Als voorbereiding 60 mm gerechten uit de secundaire glia voor neuronale dekglaasjes, verander medium om N2.1 de avond voor de neuronale dissectie.

3. Neuronale Dissectionen Cultuur

1. Bereid glas dekglaasjes (15 mm diameter) door de toevoeging van drie kleine druppels gesmolten paraplast was rond de omtrek van elke steriele dekglaasje, om fysiek de cel lagen te scheiden en te voorkomen dat cellen schrapen. Cellen worden uitgeplaat op deze kant van het dekglaasje.
2. Coat platen of dekglaasjes met 0,5 mg / ml polylysine (of poly-L-lysine of poly-D-lysine opgelost in boraatbuffer, zie tabel VI) voor 2 uur of 's nachts. Was met steriel water 2-3 keer en laat het volledig drogen. Let op: coverslips worden geplaatst in een hydrofobe petrischaaltje voorkomen dat er / verspreiding van de oplossingen tijdens het coaten met poly-lysine of mobiele plating, die gemakkelijk kan optreden als de dekglaasjes worden geplaatst in weefselkweek gerechten.
3. Bereid je voor op de neuronale dissectie als voor de glia dissectie (stap 1.1). Euthanaseren een 17-dagen zwangere ratten, spuit de vacht met 70% ethanol, en snijd mediaal door de huid naar de baarmoeder bloot te leggen. Verwijder alle foetussen en plaats ze in eensteriel 100 mm schotel.
4. Snel ontleden gratis en onthoofden elke foetus, het plaatsen van elk hoofd in zijn eigen 60 mm schaal met koud dissectie medium (4 ml). We normaal gesproken ontleden 4-5 foetussen per experiment als ongeveer 20 miljoen neuronen zijn afgeleid van elke E17 foetus. Als er meer embryo's nodig zijn, zorg ervoor dat de hele procedure (van stap 3,4 tot 3,12), niet langer dan 90 tot 100 minuten.
5. Met behulp van een stereomicroscoop en No.1/No.5 tang isoleren van de cerebrale cortex door te trekken opent de huid en de schedel, het extraheren van de hersenen, het scheiden van de hersenhelften, en het verwijderen van de middenhersenen en de hersenvliezen.
6. Verzamel alle ontleed cortex in een frisse 60 mm schaal met koud dissectie medium, en gehakt het weefsel met een gebogen schaar naar ~ 1 mm stukken.
7. Breng de gehakte weefsel om een ​​steriele 15 ml buis. Breng het volume op 4,5 ml met koude dissectie medium en voeg 500 pi van 2,5% trypsine. Wikkel de buis in Parafilm en zweven in een 36 ° C waterbad gedurende 15 Minutes, mengen door inversie om de 5 minuten.
8. Overdracht van het weefsel naar een nieuw 15 ml tube, het minimaliseren van het volume van de trypsine-bevattend medium dissectie overgedragen. Brengen tot 4,8 ml met vers dissectie medium en voeg 200 ul DNase tot een uiteindelijke concentratie van 60 ug / ml te bereiken. Vermaal ongeveer 10 keer met een steriele 5 of 2 mL pipet, herhaalt u deze stap indien nodig met behulp van een brand-gepolijst (koud) Pasteur pipet het grootste deel van het weefsel dissociëren. Laat vervolgens de resterende stukjes weefsel (over het algemeen zeer weinig of zelfs geen) om zich te vestigen voor 4-5 minuten.
9. Verwijder de bovenste single-celsuspensie terwijl achter beslecht stukjes weefsel, en plaats deze oplossing in een nieuwe buis met een gelijk volume van neuron plating medium (zie tabel III). Meng goed, maar voorzichtig, tel dan de cellen; plaat op 15 mm dekglaasjes (35.000 cellen elk in 200 pi) of 60 mm gerechten (1x10 ⁶ cellen elk in 3 ml) als dat nodig is. Overdracht van cellen in de broedstoof (36,5 ° C, 5-10% CO2).
10. Na 3-4 uur COMBINe het neuron laag en de secundaire glia als volgt. Voor de neuronen op 60 mm vaat, wassen van de cellen met warme DMEM, wijzigt de middellange tot 4 ml van serum vrij medium (N2, zie tabel IV), en voeg een thermanox met glia om elke plaat (gliacellen moet naar de neuronen). Voor de neuronale dekglaasjes, transfer 3-5 dekglaasjes voor elke 60 mm schaal van de secundaire glia, met de neuronen naar beneden.
11. 24 uur na plating de neuronen, voeg 10 uM van cytosine-β-D-arabinofuranoside bij elk gerecht, om te glia verspreiding te voorkomen. We bereiden 4 mM stockoplossingen, verdunnen 1:10 met N2 medium, en voeg 25 uL / ​​ml verdunde oplossing voor elk gerecht.
12. De cellen zijn over het algemeen gebruikt voor experimenten na 7-10 dagen in de cultuur, hoewel exacte tijd hangt af van de gewenste differentiatie fase, ze zijn gegroeid tot 4 weken zonder een significante afname in overleving. Na de eerste week, is het raadzaam dat een helft van het volume van media vervangen worden elke week.

Een paar uur na de neuronen hebben gehecht aan de ondergrond, ze beginnen te lamelliopodia uit te breiden. Processen blijven rekken (afb. 2A) en over meerdere dagen in cultuur polariseren, en uitgebreid axonen en dendrieten zijn duidelijk zichtbaar (afb. 2B; MAP2 kleuring). Als volwassen neuronen de dendritische priëlen meer uitgebreide en ontwikkelen zij synaptische contacten te leggen; ongeveer 2-3 weken na plating veel dendritische spines zichtbaar zijn (figuur 2C) ^11.

Figuur 1. Stroomschema van de procedure voor het kweken van corticale neuronen rat samen met een gliale feeder layer (secundaire glia). De eerste, 11 dagen voor de neuronale dissectie, is een primaire glia cultuur bereid uit neonatale ratten (P2-4). Wanneer de cellen samenvloeiende zijn (ongeveer negen dagen na de beplating van de primaire glia en twee dagen voor de neuronale dissectie), astrocyten zijn mechanically gescheiden van de oligodendrocyt precursor cellen en microglia en uitgeplaat, hetzij op gerechten of thermanox (secundaire glia). Neuronen zijn vervolgens verkregen uit de cortex van de E17 embryo's en vergulde, hetzij op dekglaasjes of op de vaat (bekleed met poly-lysine). Vier uur na de scheepshuid, de neuronale laag toegevoegd aan de secundaire glia.

Figuur 2 Voorbeelden van culturen in de verschillende stadia (bijv. 5 uur, 12 DIV, 21 DIV).. De cijfers zijn representatief beeld van de corticale neuronen op dekglaasjes op verschillende tijdstippen. Na de neuronen hechten aan de ondergrond neuronen beginnen te lamelliopodia uit te breiden. Fase contrast beeld toont een aantal uitgebreide neurieten vijf uur na de beplating (A). Het beeld in het midden (B, van Cook et al.. 2010, met toestemming) blijkt 12 DIV corticale neuronen vast en immunostained met de neuronale dendritische marker MAP2. Hoechst kleuring werd gebruikt als een counterstaiNing. Als neuronen rijpe dendritische spines ook zichtbaar (C). Schaal bars: A, B = 25 micrometer, C = 10 micrometer.

Discussion

Dit protocol biedt een methode voor het kweken van rat primaire corticale neuronen in de aanwezigheid van glia cellen, terwijl de neuronen gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd voor experimentele analyse. De glia helpen bij de ontwikkeling van een gezonde neuronaal fenotype, terwijl ook modulerende neuronale reacties op experimentele behandelingen in een fysiologisch relevante manier. Bovendien, door passage van de primaire glia voor het kweken met deze neuronen celpopulatie wordt selectief verrijkt met astrocyten, waardoor ze inflammatoire microgliale stimulatie. Voor bepaalde soorten experimenten, maar kunnen verschillende verhoudingen van gliacellen te wensen over, waardoor extra glia culturen kan worden uitgevoerd om deze cellulaire samenstelling te optimaliseren. Dit protocol kan ook worden aangepast voor het kweken van neuronen afgeleid van andere hersengebieden, zoals de hippocampus, om bepaalde experimentele eisen passen

Grote zorgen van deze techniek onder andere het voorkomen van bacteriële contaminering en het voorkomen van gliale proliferatie in de neuronale laag. Dit systeem bevat geen antibiotica agenten, dus steriele technieken zijn vooral van belang in alle stadia. Gliale proliferatie wordt voorkomen door de toevoeging van het anti-mitotische middel cytosine arabinofuranoside, de lage dichtheid beplating en de serum-vrij kweekmedium; na dit protocol astrocyten mag niet meer dan 3-5% van de cellen samen in de neuronale laag ^1,4 en minder dan 1% microglia moet worden gedetecteerd. Immunopanning of andere technieken kunnen worden gebruikt om zelfs dit kleine glia vervuiling ⁴ te verwijderen.

Deze techniek kan ook worden aangepast voor co-kweken van een bepaald ras van het aanklevende celtypen bij het isoleren van een type voor de analyse is gewenst. Zo werd dit systeem met succes aangepast voor het analyseren van de effecten van de osteoblasten op de Ca ^{2 +} signalisatie in bot-uitgezaaide kankercellen ^14.