Двухслойный сотрудничества культуре первичных Крыса корковых нейронов и глии

Summary

Здесь мы предлагаем протокол для культивирования нейронов коры крысы в ​​присутствии глиальных слой подачи. Культурный нейронов установить полярность и создать синапсов, и может быть отделена от глии для использования в различных приложениях, таких как электрофизиологии, кальция изображений, анализы выживаемость клеток, иммуноцитохимия, и РНК / ДНК / белок изоляции.

Protocol

1. Глия Dissection (~ 2 недели до покрытия нейронов)

1. Чтобы подготовиться к месту вскрытия стерильной инструменты в 70% этанола, добавляют 4 мл холодной среды вскрытия до 60 блюд мм (одно блюдо на головной мозг), и место 2,5% трипсина и ДНКазы на льду таять (см. подробную информацию о хирургических инструментов в таблице VI ).
2. Используйте большие ножницы, чтобы обезглавить 2-4 дневных щенков и места головы в 100 мм стерильную чашку.
3. Для использования средне ножницы, чтобы вырезать средней линии через кожу и отступить кожи подвергать черепа. Используйте изогнутые ножницы, чтобы вырезать средней линии и две боковые разрезы через череп, не повреждая под мозговой ткани. Снимите верхнюю черепа подвергать мозга.
4. Извлечение мозга и поместите его в свои 60 мм блюдо с 4 мл холодной среды вскрытия (см. таблицу I для композиции). Место блюдо под стереомикроскопа (Leica ZOOM 2000 году, увеличить контроль: 7-30) и использовать № 5 щипцы для разделения полушарий, удалить мозга, и кожица оFF мозговых оболочек.
5. Соберите все расчлененные мозговой коры в свежем 60 мм блюдо с холодной среды рассечение, и фарш ткани с изогнутыми ножницами.
6. Передача измельченной ткани в 15 мл стерильной трубки. Довести объем до 4,5 мл с холодной среды рассечение и добавить 500 мкл 2,5% трипсина. Оберните трубки в парафильмом и плавать его в 37 ° С на водяной бане 15 минут, перемешивания инверсии каждые 5 минут.

   (Примечание: здесь мы опишем протокол мы, как правило следовать при использовании до 5 мозги, а если больше щенков используются, объемы, возможно, должны быть скорректированы соответственно)

7. Передача ткани новых 15 мл трубки, сводя к минимуму объем трипсина содержащих рассечение среды переносятся. Довести объем до 4.8mL свежей средой вскрытие и добавить 200 мкл ДНКазы для достижения конечной концентрации 60 мкг / мл (маточный раствор: 3 мг ДНКазы и 5 мг MgSO 4 в 2 мл рассечение среды). Измельченного в порошок мягко ~ 20 раз стерильной пипеткой 5 млТе, затем добавить 10 мл глии среду покрытия (см. таблицу II для композиции).
8. Разрешить большие куски ткани, чтобы урегулировать в течение 4-5 минут, а затем перенести топ 80% клеточной суспензии в 50 мл трубки. Повторите ткани растирания с дополнительными 2-3 мл глии среду покрытия (и с помощью пипетки меньше, если это необходимо), и снова, позволяют ткани на поселение, и добавьте верхний 80% к предыдущей коллекции. Довести общий объем до 20 мл с глии среду покрытия и центрифуги в течение 15 минут при 280 г (или 1300 оборотов в минуту в центрифуге IEC Centra CL2).
9. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток глии в среду покрытие (примерно 5-7 мл использования в зависимости от количества щенков используется), а затем добавить дополнительные средний покрытие, чтобы иметь 10 мл для каждого мозга расчленены. Хорошо перемешайте и пластины 10 мл клеточной суспензии в каждом 75 см ² колбы (то есть один мозг в колбе).
10. Перемещение культуры в колбах термостат при температуре 37 ° С (от 5 до 10% СО2; пропорционально натрия bicarbonaТе содержание среды). Изменение культуральной среде после 24-48 часов, затем каждые 3-4 дня.

2. Вторичные Глия (48 часов до покрытия нейронов)

1. Подготовка thermanox покровные (если нейроны будут покрыты на блюдах), добавив 3 маленьких капель расплавленного воска paraplast по окружности каждого мыть и автоклавного thermanox. Клетки будут покрыты на этой стороне thermanox. Наши thermanox изготавливаются вручную многоразовые ~ 60 мм вставки, вырезанные из пластика (см. таблицу VI реагентов) с ~ 50 2 мм через отверстия, просверленные, хотя коммерчески доступных культуры и вставки могут быть использованы вместо.
2. Вымойте первичной глии с PBS в два раза, энергично встряхивая каждую колбу, чтобы удалить одиноких клеток. Каждый флакон с вырожденным первичной глии обеспечит около 10 миллионов астроглией, поэтому мы регулярно используют 2-4 колбы в эксперименте.
3. Отсоедините клеток с 0,05% tryspin-ЭДТА (1 mL10X 0,5% трипсина-EDTA маточный раствор разводят в 9 мл PBS). Combiпе клетки от 2 колбы в один 50 мл коническую пробирку и добавляют равное количество глии среду покрытия (см. таблицу II реагентов). Центрифуга в течение 15 минут при 280 g. Аспирируйте супернатант и растворить глии пеллет в нескольких мл глии среду обшивки.
4. Граф клеток с использованием гемоцитометр и разбавленных клеточной суспензии по мере необходимости (~ 1x10 ^{6 клеток} / мл); пластина клетки либо на 60 мм блюда (если нейроны будут высевали на покровные), или на thermanox покровные (если нейроны будут высевали на 60 мм посуда). Клетки должны быть покрыты на 500 тысяч клеток на блюдо или thermanox использованием среды глии обшивки. В случае thermanox покровные, пластина 600 мкл клеток в капле моды, то через 2 часа флип thermanox и погрузить в клетки глии среду обшивки.
5. При приготовлении блюд 60 мм вторичных глии на нейронную покровные, изменение средних N2.1 вечером перед нейронов рассечение.

3. Нейронные Dissectionи культуры

1. Подготовка стекла покровные (15 мм в диаметре), добавив 3 мелких капель расплавленного воска paraplast по окружности каждого стерильной покровное для того, чтобы физически отдельных слоев клеток и предотвращает ячейки выскабливание. Клетки будут покрыты на этой стороне покровного стекла.
2. Пальто пластин или покровные с 0,5 мг / мл полилизином (либо поли-L-лизина или поли-D-лизин, растворенного в буфере бората, см. таблицу VI) в течение 2 часов или на ночь. Промыть стерильной водой в 2-3 раза и дать высохнуть полностью. Примечание: покровные находятся в гидрофобных чашке Петри, чтобы избежать разлива / распространение решений во время покрытия с поли-лизина или сотового покрытия, которое легко может произойти, если покровные помещаются в блюда тканевой культуры.
3. Подготовка к нейронов рассечение как для вскрытия глии (шаг 1.1). Эвтаназии 17-дневный беременных крыс, спрей меха с 70% этанола, и сократить медиально через кожу подвергать матки. Удалите все плодов и поместите их встерильная 100 мм блюдо.
4. Быстро анализировать свободные и обезглавить каждого плода, включающих каждую голову в свои 60 мм блюдо с холодной среды рассечение (4 мл). Мы обычно рассекают 4-5 плодов в эксперименте, как примерно 20 миллионов нейронов, являются производными от каждого E17 плода. Если больше эмбрионов необходимы, чтобы убедиться, что вся процедура (от 3,4 до шагом 3,12) не длится более 90-100 минут.
5. Использование стереомикроскопа и No.1/No.5 щипцы изолировать мозговой коры, потянув открытых кожу и череп, извлечение мозга, разделяющая полушария, а также устранение среднего мозга и мозговых оболочек.
6. Соберите все расчлененные коры в свежем 60 мм блюдо с холодной среды рассечение, и фарш ткани с изогнутыми ножницами в ~ 1 шт мм.
7. Передача измельченной ткани в 15 мл стерильной трубки. Довести объем до 4,5 мл с холодной среды рассечение и добавить 500 мкл 2,5% трипсина. Оберните трубки в парафильмом и плавать его в 36 ° С водяной бане в течение 15 MinuTES, смешивая обращением каждые 5 минут.
8. Передача ткани новых 15 мл трубки, сводя к минимуму объем трипсина содержащих рассечение среды переносятся. Довести до 4,8 мл свежей средой вскрытие и добавить 200 мкл ДНКазы для достижения конечной концентрации 60 мкг / мл. Измельченного в порошок примерно в 10 раз стерильным 5 или 2 мл пипетки, повторите этот шаг как необходимый использованием огневой полировкой (холодная) пипетки Пастера отделить большинство из ткани. Тогда позвольте оставшиеся кусочки ткани (как правило, очень немногие, если таковые имеются), чтобы решить в течение 4-5 минут.
9. Снимите верхнюю одной клеточной суспензии, оставляя позади поселились кусочки ткани, и поместить это решение в новую пробирку с равным объемом среднего покрытия нейрона (см. таблицу III). Хорошо перемешайте, но осторожно, то подсчет клеток; пластины на 15 мм, покровные (35 000 ячеек, каждая в 200 мкл) или 60 мм блюд (1x10 ⁶ ячеек, каждая в 3 мл) по мере необходимости. Передача клетки инкубатора (36,5 ° C, 5-10% CO2).
10. Через 3-4 часа Комбинируяэлектронного слоя нейронов и глии вторичных следующим образом. Для нейронов на 60 мм блюд, мытье клеток с теплой DMEM, изменение средних 4 мл сыворотки свободной среде (N2, см. таблицу IV), и добавить один thermanox с глии в каждую тарелку (глиальные клетки должна быть обращена нейронов). Для нейронов покровные, передача от 3 до 5 покровные для каждого 60 мм блюдо вторичных глии, с нейронами вниз.
11. 24 часов после покрытия нейронов, добавить 10 мкМ цитозин-β-D-арабинофуранозида к каждому блюду, в целях предотвращения распространения глии. Мы готовим четыре решения мМ акции, развести 1:10 с N2 среды, и добавить 25 мкл / мл разбавленного раствора к каждому блюду.
12. Клетки, как правило, используются для экспериментов через 7-10 дней в культуре, хотя точное время зависит от желаемой стадии дифференцировки; они были выращены на срок до 4 недель без значительного снижения выживания. После первой недели, рекомендуется, что половина объема средств массовой информации заменить каждую неделю.

Через несколько часов после нейроны имеют прикреплены к субстрату, они начинают расширять lamelliopodia. Процессы продолжают удлиненные (рис. 2A) и поляризации в течение нескольких дней в культуре, а также расширенные аксоны и дендриты хорошо видны (рис. 2В; MAP2 окрашивание). Как нейроны зрелых дендритных беседки стали более продуманными и они развиваются синаптических контактов, около 2-3 недель после покрытия многих дендритных шипиков видны (рис. 2C) ^11.

Рисунок 1. Блок-схема процедуры для культивирования корковых нейронов крысы вместе с глиальных слоя фидерных (вторичный глии). Во-первых, за 11 дней до вскрытия нейронов, глии первичной культуре готовят из новорожденных крыс (Р2-4). Когда клетки сливной (примерно через девять дней после покрытия первичных глии и за два дня до нейронов рассечение), астроциты являются мехanically отделены от клеток-предшественников олигодендроцитов и микроглии и помещают либо на посуду или thermanox (вторичный глии). Нейроны затем получить коре E17 эмбрионов и покрытием либо на покровные стекла или на блюда (покрытые поли-лизина). Через четыре часа после покрытия, нейронов слоя добавляется к вторичного глии.

Рисунок 2 Примеры культур на различных этапах (например, 5 часов, 12 DIV, 21 DIV).. Цифры представитель изображений корковых нейронов на покровные стекла в различные моменты времени. После нейронов прикрепляться к субстрату нейроны начинают распространяться lamelliopodia. Изображение фазового контраста показывает несколько расширенных нейритов через пять часов после покрытия (). Изображение в середине (Б, от Кука и соавт. 2010, с разрешения) показывает 12 DIV корковых нейронов фиксированной и immunostained с нейронный маркер дендритных MAP2. Hoechst окрашивания был использован в качестве counterstaiмолнии. Как нейроны зрелых дендритных шипиков и становятся видимыми (С). Шкала бары: A, B = 25 мкм, C = 10 мкм.

Discussion

Этот протокол обеспечивает метод культивирования крысы первичных корковых нейронов в присутствии клетки глии, позволяя при этом нейроны, чтобы быть легко выделен экспериментальный анализ. Развитие глии поддержку здорового нейронов фенотипа, а также модулирующих нейронов ответы на экспериментальных процедур в физиологически соответствующим образом. Кроме того, по пассажей первичной глии до культивирования с нейронами этой клеточной популяции становится выборочно обогащенный астроцитов, тем самым предотвращая воспалительные микроглии стимуляции. Для некоторых типов экспериментов, однако, различные доли глиальных клеток может быть желательно, таким образом, дополнительные культурах глии могут быть выполнены, чтобы оптимизировать этот клеточный состав. Этот протокол также может быть адаптирована для культивирования нейронов, вытекающих из других областей мозга, такие как гиппокамп, чтобы соответствовать требованиям частности экспериментальных

Основные проблемы этого метода включают предотвращение бактериальных продолжениеаминирования и предотвращения попадания ядерного оружия в глиальных нейронов слоя. Эта система не включает в себя антибиотики, таким образом, стерильные методы особенно важны на всех этапах. Глиальные распространения предотвращается путем добавления анти-митотический агент цитозин арабинофуранозида, низкая плотность покрытия и бессывороточной культуральной среде, следуя этому протоколу астроциты должна составлять не более 3-5% клеток нейронов ^1,4 слоя и менее 1% микроглии должны быть обнаружены. Immunopanning или другие методы могут быть использованы для удаления даже на таком низком уровне загрязнения глии ^4.

Этот метод также может быть модифицирован для совместного культивирования любой разновидности приверженцем типов клеток при вычленении одного типа для анализа является желательным. Например, эта система была успешно адаптирована для анализа воздействия на остеобласты Са ^{2 +} сигнализации в кости метастатических раковых клеток ^14.