차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

Summary

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

Abstract

이 비디오는 glial 피더 층, bilaminar 또는 공동 문화 모델로 알려진 시스템의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런의 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 이 시스템은 유리 또는 플라스틱의 성장 기판 중 하나를 필요로하는 실험이 필요 다양한하기에 적합하며 뉴런의 다른 유형의 문화도 사용할 수 있습니다.

후반 배아 단계 (E17)에서 얻은 쥐 대뇌 피질의 뉴런은 유리 coverslips 또는 각각 접시 또는 플라스틱 coverslips (Thermanox라고도 함)에 대한 성장 glia의 피더 레이어를 마주 조직 문화 요리에 도금입니다. 두 구성 사이의 선택은 특정 실험 요구할 수 사용 기법, 또는하지에 따라, 그 뉴런이 유리 (예 : 칼슘 이미징 비해 서양 얼룩)에 성장하고 있습니다. glial 피더 레이어 혼합 glia의 astroglia - 풍부한 차 문화, 별도의 연결을하기 전에 신생아 쥐 새끼의 cortices (P2 - 4)에서 준비가되어 있습니다해부.

뉴런의 문화에 비해이 문화 시스템의 가장 큰 장점은의 연결을 성장, 생존, 그리고보다 정확하게 생체내의 뇌는 환경과 유사한 glial 피더 계층에서 분비 영양 요소에서 제공하는 분화의 지원입니다. 또한, 공동 문화의 연결 - glial 상호 작용 ¹ 공부하는 데 사용할 수 있습니다.

동시에,의 연결 레이어에 glia 오염은 다른 설립 방법 ¹ 비교 사실상 순수의 연결 레이어에 이르는 다른 수단 (저밀도 문화, mitotic 억제제의 추가, 최적화된 배지의 혈청 및 사용의 부족)에 의해 차단됩니다 ^-3. 뉴런은 쉽게 문화 중에 언제든지 glial 계층에서 분리하고 전기 생리학 ⁴ 세포와 분자 생물학 ^5-8, 생화학 ^5, 이미징 및 마이크에 이르기까지 다양한 실험적인 애플 리케이션에 사용될 수 있습니다roscopy ^4,6,7,9,10. 기본 뉴런 일부 세포 라인 프로세스를 확장 할하지만, 기능 시냅스의 연결에게 셀 라인에서 관찰되지 않는 프로세스를 ¹¹ 형태 axons과 dendrites을 연장.

이 공동 문화 시스템을 사용 culturing 쥐 hippocampal 뉴런의 상세한 프로토콜은 이전에 설명한 ^{4,12,13되었습니다.} 여기 세부 대뇌 피질 뉴런에 적합 수정된 프로토콜을. 약 20x10 ⁶ 셀 각 쥐의 배아에서 발견한 있으므로,이 방법은 뉴런 (그러나 매우 동질적인 인구의 연결에 대해 우려하지 않음) 많은 숫자가 필요한 실험에 특히 유용합니다. 뉴런과 glia의 준비 시간을 특정 방식으로 계획해야합니다. 우리는 뉴런을 지원하기 위해 단계별 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜뿐만 아니라 culturing glial 세포를 제공할 것입니다.

Protocol

1. Glia의 해부 (~ 이주 도금 뉴런 전)

1. 70 % 에탄올에 절개 장소 살균 도구를 준비하려면, (표 VI에서 수술 도구에 대한 자세한 내용을 볼 녹여 얼음 4 ML 차가운 해부 매체 60mm의 요리 (두뇌 당 한 접시), 장소 2.5 % 트립신과 DNase를 추가 ).
2. 100mm 살균 접시에 2-4일 오래된 새끼과 장소 헤드 목을 벨로 큰​​ 가위를 사용합니다.
3. 피부를 통해 중간선 인하를하고 두개골을 노출하기 위해 피부를 다시 끌어 중간 가위를 사용합니다. 뇌 조직 아래를 손상하지 않고, 중간선 잘라 두개골을 통해 두 측면 상처를 만들기 위해 곡선 가위를 사용합니다. 뇌를 노출 상단 두개골을 제거합니다.
4. 두뇌를 추출하고 (구성을 위해서 테이블을 참조) 4 ML 차가운 해부 매체를 포함하는 자체 60mm 접시에 넣습니다. stereomicroscope (Leica 줌 2000, 줌 제어 : 70-30)에서 접시를 놓고 반구를 분리하는 5 번 집게를 사용하여, midbrain을 제거하고 껍질 OFF meninges.
5. 차가운 해부 매체와 신선한 60mm 요리의 모든 해부 대뇌 cortices를 수집하고, 곡선 가위로 조직을 말하다.
6. 멸균 15 ML 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 차가운 해부 매체와 4.5 ML에 볼륨을 준비하고 2.5 %의 트립신 500 μL를 추가합니다. Parafilm에 튜브를 싸서 역전 매 5 분 믹싱, 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 떠.

   (참고 : 여기서 우리가 최대 5 머리에 사용하는 경우에는 우리가 일반적으로 다음과 프로토콜을 설명, 더 많은 새끼를 사용하는 경우, 볼륨이 적절하게 조정해야 할 수도 있습니다)

7. 이월 트립신 함유 해부 매체의 볼륨을 최소화, 새로운 15 ML 튜브에 조직을 전송합니다. 신선한 해부 매체와 4.8mL에 볼륨을 가지고 60 ug / ML (재고 솔루션 : DNase 및 해부 매체 2 ML 5 MG MgSO4 3 MG)의 최종 농도에 도달 200 μL DNase를 추가합니다. 멸균 5 ML의 pipet과 함께 부드럽게 ~ 20 번 씹다테는 다음 (구성에 대한 테이블 II 참조) glia 도금 매체의 10 ML를 추가합니다.
8. 4~5분을 받아들여야 조직의 큰 조각을 허용 다음 50mL 튜브에 세포 현탁액의 상단 80 %를 전송합니다. glia 도금 매체의 추가 2-3 ML (및 필요한 경우 작은 피펫을 사용하여)과 조직 분쇄를 반복, 다시 조직이 정착하도록하고, 이전 컬렉션 가기 80 %를 추가합니다. 280에서 15 분 동안 glia 도금 매체와 원심 분리기 20 ML로 전체 볼륨을 가지고 g (또는 IEC Centra CL2의 원심 분리기에서 1300 RPM).
9. 뜨는을 기음과 glia 도금 매체에있는 세포 펠렛을 (약 사용 새끼의 수에 따라 5-7 ML 사용) resuspend, 다음 해부 각 뇌의 10 ML을 위해 추가적인 도금 매체를 추가합니다. 각 75cm ² 플라스크 (술병 당 즉, 일사불란)에 잘와 플레이트 세포 현탁액의 10 ML을 섞는다.
10. 37 보육 집합 문화 flasks를 이동 ° C CO2 (5-10%, 나트륨 bicarbona에 비례매체의 테 컨텐츠). 다음 24-48시간, 모든 3-4일 후 배지를 변경합니다.

2. 보조 Glia (도금 뉴런 전 48시간)

1. 각 세탁 및 autoclaved thermanox의 원주 주위에 녹은 왁스 paraplast 3 작은 방울을 추가하여 thermanox coverslips을 (뉴런이 요리 도금 될 경우) 준비합니다. 세포는 thermanox의 측면에 도금 것입니다. 상용 문화가 잘 삽입을 대신 사용할 수 있지만 우리 thermanox가를 통해 뚫고 ~ 50 2mm 구멍이있는 플라스틱 (시약의 표 VI 참조)에서 잘라 손으로 재사용 ~ 60mm 삽입됩니다.
2. 적극적으로 모든 무소속 세포를 제거하는 각각의 플라스크를 흔들어, PBS로 두 번 기본 glia 씻으십시오. 합류 기본 glia 각 플라스크는 약 10,000,000 astroglia를 제공합니다, 그러므로 우리는 정기적으로 실험마다 2-4 flasks을 사용합니다.
3. 0.05 % tryspin - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (PBS 9 ML에 희석 한 mL10X 0.5 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 주식 솔루션)와 세포를 분리합니다. CombiNE는 한 50 ML 원뿔 튜브로 2 flasks의 세포 및 (시약의 표 II 참조) glia 도금 매체의 동일한 금액을 추가합니다. 280 G.에서 15 분 동안 원심 분리기 뜨는을 기음과 glia 도금 매체 몇 ML에 glia 펠렛를 해산.
4. hematocytometer를 사용하여 세포를 카운트하고 (~ 1x10 ⁶ 셀 / ML) 필요에 따라 세포 현탁액을 희석, 플레이트는 (60mm 요리 (뉴런이 coverslips에 도금 될 경우), 또는 thermanox의 coverslips에 두 세포는 뉴런이에 도금 될 경우 60mm 요리). 전지는 접시 또는 glia 도금 매체를 사용하여 thermanox 당 500,000 세포에 도금한다. 다음 이시간 glia 도금 매체에 플립 thermanox 및 잠수함 세포 후 thermanox coverslips, dropwise 방식으로 세포의 판 600 μL의 경우에는.
5. 의 연결을 coverslips을위한 보조 glia의 60mm 요리를 준비하는 경우의 연결을 절개하기 전에 저녁 N2.1로 매체를 변경할 수 있습니다.

3. 의 연결을 해부문화

1. 물리적으로 세포 레이어를 분리하여 세포 스크레이핑을 방지하기 위해, 각 멸균 coverslip의 원주 주위에 녹은 왁스 paraplast 3 작은 방울을 추가하여 유리 coverslips (15mm 직경)을 준비합니다. 세포는 coverslip의 측면에 도금 것입니다.
2. 코트 플레이트 또는 0.5 MG / ML polylysine (중 폴리 - L - 라이신 또는 borate 버퍼에 녹아있는 폴리 - D - 라이신, 테이블 VI 참조) coverslips 이시간 또는 밤새하십시오. 멸균 물을 2-3 번 씻고 완전히 건조 수 있습니다. 참고 : coverslips이 coverslips가 조직 문화 요리에 배치하는 경우 쉽게 발생할 수있는 폴리 - 라이신 또는 셀 도금과 함께 코팅 동안 흘리고 / 솔루션의 확산 방지에 소수성 페트리 접시에 배치됩니다.
3. glia의 해부 (단계 1.1)에 대한로의 연결을 해부 준비. 17 일 임신 쥐를 안락사, 70 % 에탄올로 모피를 스프레이하고, 자궁을 노출 피부를 통해 medially 했네요. 모든 fetuses를 제​​거하고 그들을 대신멸균 100mm 요리.
4. 신속하게 차가운 해부 매체 (4 ML)와 자체 60mm 요리의 각 머리를 배치, 무료 해부하다 각 태아 목을 벨. 약 20,000,000 뉴런은 각 E17 태아에서 파생된로 우리는 일반적으로 실험마다 4-5 fetuses을 해부하다. 더 많은 배아가 필요한 경우, 전체 절차 (단계 3.4-3.12에서)이 90-1백분보다 마지막으로 더 있지 않은지 확인하십시오.
5. stereomicroscope 및 No.1/No.5 집게를 사용하면, 피부와 두개골을 열고 당기는 두뇌를 추출, 반구를 분리하고, midbrain과 meninges을 제거하여 대뇌 cortices을 분리.
6. 차가운 해부 매체와 신선한 60mm 요리의 모든 해부 cortices를 수집하고 ~ 1mm의 조각으로 굽은 가위로 조직을 말하다.
7. 멸균 15 ML 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 차가운 해부 매체와 4.5 ML에 볼륨을 준비하고 2.5 %의 트립신 500 μL를 추가합니다. 15 minu에 대한 Parafilm에 튜브를 싸서 36 ° C의 물을 욕조에 플로트역전으로 5 분마다 혼합 tes.
8. 이월 트립신 함유 해부 매체의 볼륨을 최소화, 새로운 15 ML 튜브에 조직을 전송합니다. 신선한 해부 매체와 4.8 ML 가져오기 60 ug / ML의 최종 농도에 도달 200 μL DNase를 추가합니다. 멸균 5 또는 2 ML의 피펫과 함께 약 10 번 씹다, (감기) 화재 - 광택 파스퇴르 피펫은 조직의 대부분을 떼어 놓다 위해 사용 필요에 따라이 단계를 반복합니다. 4~5분을 받아들여야 그렇다면 (있는 경우 일반적으로 거의)이 조직의 남은 조각 수 있습니다.
9. 조직의 정착 조각 뒤에 떠나는 동안 위 단일 셀 서스펜션을 제거하고 신경 세포 도금 매체의 동일한 볼륨 (표 III 참조) 새로운 튜브에이 솔루션을 넣으십시오. 하지만 부드럽게 잘 혼합 후, 세포를 포함, 15mm coverslips (200 μL에서 35,000 전지 각) 또는 60mm 요리 (1x10 ⁶ 셀 3 ML의 각)에 플레이트가 필요. 인큐베이터 (36.5 ° C, 5~10%의 CO2)로 세포를 전송합니다.
10. 3-4시간의 COMBIN 후E는 신경 세포의 레이어와 보조 glia은 다음과 같습니다. 60mm 요리에 신경 들어, 따뜻한 DMEM으로 세포를 씻어 혈청 무료 매체의 4mL (N2, 표 IV 참조) 매체를 변경하고 각 플레이트 (glial 세포가 뉴런에 직면한다)에 glia 한 thermanox를 추가합니다. 아래층으로 직면하고있는 뉴런의 연결과 함께 coverslips, 보조 glia의 각 60mm 요리로 전송 3-5 coverslips.
11. 24시간 뉴런을 도금 후, glia 확산을 방지하기 위해, 각각의 접시에 사이 토신 - β - D - arabinofuranoside 10 μm의를 추가합니다. 우리는 4 MM 주식 솔루션을 준비 N2 매체와 1시 10분을 희석, 25 UL / 각 접시에 희석 솔루션의 ML을 추가합니다.
12. 정확한 시간은 원하는 차별화의 단계에 따라 달라집니다 있지만 셀은 일반적으로, 문화에 70~10일 후 실험에 사용되는, 그들은 생존에 큰 감소없이 사주까지 성장했습니다. 첫번째 주 후에, 그것은 미디어의 절반 볼륨이 매주 교체하는 것이 좋습니다.

뉴런은 기판에 부착된 가지고 몇 시간 후, 그들은 lamelliopodia을 연장 시작합니다. 프로세스가 길어지다 (그림 2A)와 문화에 며칠 동안 분극 계속 및 확장 axons과 dendrites는 (그림 2B, MAP2 얼룩) 명확하게 볼 수 있습니다. 뉴런은 돌기 arbors 더 정교한되고 성숙하고 그들은 시냅스 연락처를 개발로서, 약 2~3주 많은 돌기 쪽이을 도금 후 표시 (그림 2C) ^11입니다.

그림 1. glial 피더 층 (보조 glia)와 함께 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 절차의 플로우 차트. 먼저, 11 일의 연결을 절개하기 전에 기본 glia 문화 신생아 쥐 (P2 - 4)에서 준비가되어 있습니다. 세포가 합류하는 경우 (약 구일의 연결을 절개하기 전에 기본 glia 두 일 도금 후), astrocytes가 mech입니다anically 요리 또는 thermanox에 oligodendrocyte 전구체 세포 microglia 및 도금하거나 (보조 glia)에서 분리. 뉴런은 다음 E17 배아와 coverslips 또는 요리 (폴리 - 라이신과 코팅)에 중 도금의 cortices에서 얻을 수 있습니다. 도금 후 네 시간은,의 연결 계층은 2 차 glia에 추가됩니다.

그림 2 여러 단계에서 문화의 예 (예 : 5시간, 12 DIV, 21 DIV).. 수치는 다른 시간 시점에서 coverslips에서 대뇌 피질의 뉴런의 대표적인 이미지입니다. 뉴런가 첨부 후 기판 뉴런은 lamelliopodia을 연장 시작합니다. 위상 콘트라스트 이미지가 5 시간 도금 후 몇 가지 확장 neurites를 (A)를 보여줍니다. 중간에 이미지 (B, 쿡 외. 2010, 허가)는 고정하고의 연결 돌기 마커 MAP2와 immunostained 12 DIV 대뇌 피질의 뉴런을 보여줍니다. Hoechst의 얼룩은 counterstai로 사용되었다닝. 뉴런이 돌기의 쪽이을 성숙으로 또한 (C) 표시됩니다. 스케일 바 : A, B = 25 μm의, C = 10 μm의.

Discussion

뉴런 쉽게 실험 분석을 위해 격리 수 있도록하면서이 프로토콜은, glia 세포의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 기본 방법을 제공합니다. 건강의 연결 표현형의 glia 지원 개발하는 동안 생리학 관련성이 높은 방식으로 실험 트리 트먼트도 modulating의 연결 반응. 또한, 따라서 염증 microglial 자극을 방지하는이 세포 인구가 선택 astrocytes에 농축되는 뉴런과 culturing하기 전에 기본 glia를 passaging하여. 실험의 특정 유형에 대한 그러나, glial 세포의 서로 다른 비율은 따라서 추가 glia 문화이 세포 조성을 최적화하기 위해 수행할 수 원하는 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 특정 실험의 요구에 맞게 같은 해마와 같은 다른 뇌 영역에서 파생된 culturing의 뉴런,에 맞게 수

이 기술의 주요 관심사는 박테리아 cont를 방해 포함amination와의 연결 레이어에 glial 확산을 방지. 이 시스템은 따라서 멸균 기술은 모든 단계에서 특히 중요하다, 항생제 요원을 포함하지 않습니다. Glial 확산이 방지 mitotic 에이전트 사이 토신 arabinofuranoside, 저밀도 도금과 혈청이없는 배지의 추가에 의해 예방할 수 있습니다,이 프로토콜 astrocytes를 따라하면의 연결 레이어 ^1,4에서 세포의 더 이상 3-5 이상의 %를 작성한다 그리고 1 % 미만의 microglia가 감지되어야합니다. Immunopanning 또는 다른 기법도이 낮은 glia 오염 ^4를 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

바람직 분석을 위해 하나의 유형을 분리하면이 기술은 또한 자기편 세포 유형의 공동 culturing 모든 다양한 수정할 수 있습니다. 예를 들어,이 시스템이 성공적으로 칼슘 ² osteoblasts의 효과를 분석 맞게되었다 ⁺ 뼈가 전이성 암 세포 ¹⁴ 신호.