Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia

Summary

Här ger vi ett protokoll för kortikala odling råtta neuron i närvaro av en stödjeceller feeder lager. Den odlade nervceller skapa polaritet och skapa synapser och kan separeras från Glia för användning i olika applikationer, såsom elektrofysiologi, kalcium bildhantering, cell analyser överlevnad, immuncytokemiundersökning och RNA / DNA / protein isolering.

Abstract

Denna video kommer att guida dig genom processen att kortikala odling råtta neuron i närvaro av en gliaceller feeder lager, ett system som kallas en bilaminar eller co-kultur-modellen. Detta system är lämpligt för en mängd olika experimentella behov som kräver antingen ett glas eller plast tillväxt substrat och kan även användas för odling av andra typer av nervceller.

Rat kortikala neuroner från det sena embryonala stadium (E17) är pläterade på glas täckglas eller vävnad rätter kultur inför en feeder lager av Glia odlas på rätter eller plast täckglas (sk Thermanox), respektive. Valet mellan de två konfigurationer beroende på den specifika används experimentell teknik, som kan kräva, eller inte, är att nervceller som odlas på glas (t.ex. kalcium imaging kontra Western blot). Den gliaceller feeder layer, en astroglia berikade sekundära kultur blandad Glia, separat förberedd från cortex av nyfödda råttungar (P2-4) innan den neuronaladissekering.

En stor fördel med denna kultur-system jämfört med en kultur av nervceller är bara stöd av neuronala tillväxt, överlevnad och differentiering som trofiska faktorer som utsöndras från gliaceller mataren lagret, vilket bättre liknar hjärnan miljön in vivo. Dessutom kan samtidig kulturen användas för att studera neuronala-glial interaktioner ^1.

Samtidigt är Glia föroreningar i neuronala lager förebyggas på olika sätt (låg täthet kulturen, tillägg av mitotiska hämmare, brist på serum och användning av optimerade odlingsmedium) leder till en nästan ren neuronal skikt, jämförbart med andra etablerade metoder ^{1 -3.} Nervceller kan separeras från gliaceller lagret när som helst under kultur och användas för olika experimentella applikationer från elektrofysiologi ^4, cell-och molekylärbiologi ^5-8, biokemi ^5, bildhantering och mikrofonroscopy ^4,6,7,9,10. Den primära neuron förlänga axoner och dendriter för att bilda fungerande synapser ^11, en ​​process som inte observerats i neuronala cellinjer, även om vissa cellinjer sträcker processer.

En detaljerad protokollet av hippocampus odling råtta neuron med hjälp av detta samarbete kultur-systemet har beskrivits tidigare ^4,12,13. Här har vi närmare ett modifierat protokoll lämpad för kortikala neuroner. Som ca 20x10 ⁶ celler återvinns från varje råtta embryo, är denna metod särskilt användbar för experiment som kräver ett stort antal nervceller (men inte om en mycket homogen neuronal befolkningen). Beredningen av nervceller och Glia måste planeras i en tid-specifika sätt. Vi kommer att ge steg-för-steg-protokoll för kortikala odling råtta neuron samt odling gliaceller att stödja nervceller.

Protocol

1. Glia Dissection (~ 2 veckor innan plätering nervceller)

1. För att förbereda den sterila dissektion plats verktyg i 70% etanol, tillsätt 4 ml kallt dissekering medellång till 60 mm maträtter (en maträtt per hjärnan), och placera 2,5% trypsin och DNas på is för att tina (se information om kirurgiska instrument i tabell VI ).
2. Använd stora sax för att halshugga 2-4 dagar gamla ungar och leder till en 100 mm steril maträtt.
3. Använd medelstora sax för att göra en mittlinje skär genom huden och dra tillbaka huden att exponera skallen. Använd böjd sax för att göra en mittlinje klippa och två laterala skär genom skallen, utan att skada under hjärnvävnaden. Ta bort den övre skallen att exponera hjärnan.
4. Utdrag hjärnan och placera den i sin egen 60 mm maträtt innehållande 4 ml kallt dissektion medium (se tabell I för sammansättning). Placera skålen under ett stereomikroskop (Leica ZOOM 2000, zoomkontroll: 70-30) och använd No.5 pincett för att separera halvkloten, ta bort mellanhjärnan, och skal off hjärnhinnorna.
5. Samla alla dissekerade hjärnbarken i en fräsch 60 mm tallrik med kall dissektion medium och finhacka vävnaden med böjd sax.
6. Överför det malda vävnaden till en steril 15 ml tub. Koka upp volymen till 4,5 ml med kallt dissektion medelstora och lägga 500 mikroliter på 2,5% trypsin. Linda röret i Parafilm och flyter den i en 37 ° C vattenbad i 15 minuter, blanda genom att vända var 5 minuter.

   (Obs: Här beskriver vi det protokoll som vi vanligtvis börjar använda upp till fem hjärnor, om fler valpar används, kan volymerna behöva justeras på lämpligt sätt)

7. Överför vävnaden till en ny 15 ml tub, minimera mängden trypsin innehåller dissektion medelstora överförts. Ta volymen till 4.8mL med färska dissektion medelstora och tillsätt 200 mikroliter DNas att nå en slutlig koncentration på 60 mg / ml (stamlösning: 3 mg DNas och 5 mg MgSO4 i 2 ml dissektion medium). Kör det försiktigt ~ 20 gånger med en steril 5 ml pipettTe och tillsätt sedan 10 ml Glia plätering medium (se tabell II för sammansättning).
8. Tillåt stora bitar av vävnad att bosätta sig i 4-5 minuter, sedan överföra den övre 80% av cellsuspensionen till en 50mL rör. Upprepa vävnaden trituration med ytterligare 2-3 ml Glia plating medium (och använda en mindre pipett om det behövs), igen, gör vävnaden att bosätta sig och lägga upp 80% till den tidigare samlingen. Ta med den totala volymen till 20 ml Glia plätering medium och centrifugera i 15 minuter vid 280 g (eller 1300 rpm i en IEC Centra CL2 centrifug).
9. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i Glia plätering medium (ungefär med 5-7 ml beroende på antalet använda ungar) och sedan lägga till ytterligare bordläggning medel för att få 10 ml för varje dissekeras hjärnan. Blanda väl och platta 10 ml cellsuspension i varje 75 cm ^2-kolv (dvs en hjärna per flaska).
10. Flytta kultur kolvar till en inkubator inställd på 37 ° C (5 till 10% CO2, proportionell mot natrium bicarbonaTe innehållet i mediet). Ändra odlingsmedium efter 24-48 timmar, därefter var 3-4 dagar.

2. Sekundär Glia (48 timmar innan plätering nervceller)

1. Förbered thermanox täckglas (om nervceller kommer att pläterade på disk) genom att lägga tre små droppar av smält paraplast vax runt omkretsen av varje tvättas och autoklaveras thermanox. Cellerna kommer att pläterade på denna sida av thermanox. Vår thermanox är handgjorda återanvändbara ~ 60 mm skär skära av plast (se tabell VI reagenser) med ~ 50 2 mm hål borras igenom, även kommersiellt tillgängliga kulturen och insatser kan användas i stället.
2. Tvätta primära Glia med PBS två gånger, kraftigt skakade varje kolv för att avlägsna lös celler. Varje kolv med konfluenta primära Glia kommer att ge ungefär 10 miljoner astroglia, därför vi regelbundet använder 2-4 flaskor per försök.
3. Lossa cellerna med 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% trypsin-EDTA stamlösning spädas med 9 mL PBS). Combine de celler från 2 kolvarna till en 50 ml koniska rör och tillsätt en lika stor mängd Glia plätering medium (se tabell II av reagenser). Centrifugera i 15 minuter vid 280 g. Aspirera supernatanten och lös Glia pelleten i några ml Glia plätering medium.
4. Räkna celler med hjälp av en hematocytometer och späd cellsuspensionen som behövs (~ 1x10 ⁶ celler / ml), plattans cellerna antingen på 60mm rätter (om nervceller kommer att pläterade på täckglas), eller på thermanox täckglas (om nervceller kommer att pläterade på 60 mm rätter). Celler bör vara klädd på 500 tusen celler per maträtt eller thermanox med medelhög Glia plätering. Vid thermanox täckglas, plåt 600 mikroliter av celler i ett droppvis mode, sedan efter 2 timmar flip thermanox och celler nedsänkas i Glia plätering medium.
5. Om förbereder 60 mm rätter av sekundära Glia för neuronala täckglas, ändra medium till N2.1 kvällen före neuronala dissekering.

3. Neuronal Dissectionoch kultur

1. Förbered glas täckglas (15 mm diameter) genom att lägga tre små droppar av smält paraplast vax runt omkretsen av varje sterilt täckglas, för fysiskt att separera cellagren och förhindra cell skrapning. Cellerna kommer att pläterade på denna sida av täckglas.
2. Coat plattor eller täckglas med 0,5 mg / ml polylysine (antingen poly-L-lysin eller poly-D-lysin löst i boratbuffert, se tabell VI) i 2 timmar eller över natten. Tvätta med sterilt vatten 2-3 gånger och låt torka helt. Obs: täckglas placeras i en hydrofob petriskål att undvika att spilla / spridning av lösningar under beläggning med poly-lysin eller cell plätering, som lätt kan uppstå om täckglas placeras i maträtter vävnadskultur.
3. Förbered för neuronala dissekering som för Glia dissektion (steg 1,1). Euthanize en 17-dagars dräktiga råttor, spraya pälsen med 70% etanol, och skär medialt genom huden att exponera livmodern. Ta bort alla foster och placera dem i ensteril 100 mm maträtt.
4. Snabbt dissekera gratis och halshugga varje foster, placera varje chef i sin egen 60 mm tallrik med kallt dissektion medelhög (4 ml). Vi dissekera normalt 4-5 foster per försök som cirka 20 miljoner nervceller härrör från respektive E17 foster. Om fler embryon som behövs, se till att hela proceduren (från steg från 3,4 till 3,12) inte varar mer än 9-10 minuter.
5. Använda ett stereomikroskop och No.1/No.5 pincetten isolera hjärnbarken genom att dra öppna hud och skalle, extrahera hjärnan, separera halvkloten, och ta bort mitthjärnan och hjärnhinnorna.
6. Samla alla dissekerat cortex i en fräsch 60 mm tallrik med kall dissektion medium och finhacka vävnaden med böjd sax i ~ 1 mm bitar.
7. Överför det malda vävnaden till en steril 15 ml tub. Koka upp volymen till 4,5 ml med kallt dissektion medelstora och lägga 500 mikroliter på 2,5% trypsin. Linda röret i Parafilm och flyter den i en 36 ° C vattenbad i 15 MinuTES, blanda genom att vända var 5 minuter.
8. Överför vävnaden till en ny 15 ml tub, minimera mängden trypsin innehåller dissektion medelstora överförts. Ta till 4,8 ml med färska dissektion medelstora och tillsätt 200 mikroliter DNas att nå en slutlig koncentration på 60 mg / ml. Kör det ungefär 10 gånger med en steril 5 eller 2 ml pipett, upprepa detta steg som behövs med hjälp av en brand-polerat (kall) pasteurpipett att skilja de flesta av vävnad. Låt sedan återstående bitar av vävnad (i allmänhet mycket få, om några) att bosätta sig i 4-5 minuter.
9. Ta bort den övre encelliga fjädring medan bakom bosatte sig bitar av vävnad, och placera denna lösning i ett nytt rör med en lika stor volym av neuron plätering medium (se tabell III). Blanda väl men försiktigt, sedan räkna cellerna, plattan på 15 mm täckglas (35.000 celler vardera 200 mikroliter) eller 60 mm rätter (1x10 ⁶ celler vardera i 3 ml) som behövs. Överför celler till inkubatorn (36,5 ° C, 5-10% CO2).
10. Efter 3-4 timmar KOMBINe neuron lagret och den sekundära Glia följande. För nervceller på 60 mm rätter, tvätta cellerna med varmt DMEM, ändra medellång till 4 ml serum fritt medium (N2, se tabell IV), och lägg en thermanox med Glia på varje platta (gliaceller ska vara vänd nervceller). För neuronala täckglas, överföring från 3 till 5 täckglas till varje 60 mm maträtt av sekundära Glia med nervceller nedåt.
11. 24 timmar efter bordläggning nervceller, tillsätt 10 mikroM av cytosin-β-D-arabinofuranoside till varje maträtt, för att förhindra Glia spridning. Vi förbereder 4 lösningar mM lager, späd 1:10 med N2 medium och tillsätt 25 UL / ml utspädd lösning till varje rätt.
12. Cellerna används i allmänhet för experiment efter 7-10 dagar i kultur, även om exakt tid beror på önskad differentiering skede, de har vuxit upp till 4 veckor utan att en signifikant minskning i överlevnad. Efter den första veckan, rekommenderas att en halv volym medier bytas ut varje vecka.

Några timmar efter att nervceller har fäst på underlaget, börjar de att förlänga lamelliopodia. Processer fortsätta att förlänga (Fig. 2A) och polarisera under flera dagar i kultur, och utökade axoner och dendriter syns tydligt (fig 2b, MAP2 färgning). Som nervceller mogna dendritiska hållare blir mer avancerade och de utvecklar synaptiska kontakter, cirka 2-3 veckor efter bordläggning många Dendritutskotten är synliga (Fig. 2C) ^11.

Figur 1. Flödesschema för förfarandet för kortikala odling råtta neuron tillsammans med en gliaceller feeder layer (sekundär Glia). Först 11 dagar före neuronala dissektion, är en primär Glia kultur beretts av neonatala råttor (P2-4). När cellerna konfluenta (ungefär nio dagar efter bordläggning den primära Glia och två dagar innan den neuronala dissekering), astrocyter är mekanically separeras från oligodendrocyte föregångare celler och mikroglia och pläterade antingen på rätter eller thermanox (sekundär Glia). Nervceller är då erhålls från cortex av E17 embryon och pläterade antingen på täckglas eller rätter (belagd med poly-lysin). Fyra timmar efter plätering är neuronala lagret läggs till de sekundära Glia.

Figur 2 Exempel på kulturer i olika stadier (t.ex. 5 timmar, 12 DIV, 21 DIV).. Siffrorna är representativa bilder av kortikala neuroner på täckglas vid olika tidpunkter. Efter nervceller fäster på substratet nervceller börjar att förlänga lamelliopodia. Faskontrast bilden visar några utökade neurites fem timmar efter plätering (A). Bilden i mitten (B, från Cook et al. 2010, med tillstånd) visar 12 DIV kortikala neuroner fast och immunostained med neuronala dendritiska markör MAP2. Hoechst färgning användes som counterstaiNing. Som nervceller mogna Dendritutskotten också bli synlig (C). Skala staplar: A, B = 25 ìm, C = 10 mikrometer.

Discussion

Detta protokoll ger en metod för primär odling råtta kortikala neuron i närvaro av gliaceller, samtidigt som nervceller lätt kan isoleras för experimentell analys. Den Glia stödja utvecklingen av en sund neuronala fenotypen, samtidigt modulerande neuronal svar på experimentella behandlingar i en fysiologiskt relevant sätt. Dessutom, genom passaging den primära Glia innan odling av nervceller denna cell befolkningen blir selektivt anrikas i astrocyter och därmed förhindra inflammatoriska microglial stimulering. För vissa typer av experiment kan dock olika proportioner av gliaceller att önska, vilket ytterligare Glia kulturer kan utföras för att optimera denna cellulära sammansättning. Detta protokoll kan också anpassas för odling nervceller från andra delar av hjärnan, exempelvis hippocampus, för att passa särskilda experimentella krav

Viktigaste frågorna för denna teknik ingår att förebygga bakteriell fortsamination och förebygga gliaceller spridning i neuronala lager. Detta system omfattar inte antibiotika agenter, vilket sterila tekniker är särskilt kritiskt på alla stadier. Gliaceller spridning förhindras genom tillsats av anti-mitotiska agent cytosin arabinofuranoside, den låg densitet bordläggning och serumfritt odlingsmedium, efter detta protokoll astrocyter borde skriva mer än 3-5% av celler i neuronala lagret ^1,4 och mindre än 1% mikroglia ska identifieras. Immunopanning eller andra tekniker kan användas för att ta bort även denna låga Glia föroreningar ^4.

Denna teknik kan också modifieras för samarbete odling någon sort från tillhörande celltyper när isolera en enda typ av analys är önskvärd. Till exempel var detta system framgångsrikt anpassat för att analysera effekterna av osteoblaster om Ca ^{2 +-signalering} i ben-metastaserande cancerceller ^14.