Summary
बेसोफिल सक्रियण परीक्षण IgE-निर्भर एलर्जी का पता लगाने के के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है
Protocol
1. दवा conjugates की तैयारी
- एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 1 मिलीलीटर DH 2 हे में 10 मिलीग्राम लोमो भंग. आगे बढ़ने में इस लोमो समाधान के 95 μl का उपयोग करें. पीपी संयुग्म HSA 500 μl 0.3 एम सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) में 30.4 मिलीग्राम पीपी व्युत्पन्न (304 छ / mol) को भंग.
- (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर पीएच - भंग लोमो के 6,5 करने के लिए 95 μl 430.6 μl DH 2 हे और 100 0.5 μl 2 एम जोड़ें. 33.1 μl DH 2 हे और 2 एम एमईएस बफर पीएच 2.9 की 140 पीपी नमूना μl जोड़ें.
- हौसले से तैयार एन एथिल - एन के 57.5 μl जोड़ें - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (EDC) शेयर 100 के एक मिलीग्राम / एमएल लोमो नमूना एकाग्रता, या 10 μl EDC के समाधान के लिए के साथ DH 2 हे में भंग समाधान पीपी नमूना. 1 मिनट के लिए नमूने भंवर.
- प्रत्येक नमूने के 118 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के साथ HSA समाधान के 16.9 μl जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए नमूनों को सेते हैं, जबकि 300 राउंड / मिनट में मिलाते हुए.
- कई प्रत्येक घंटे के लिए 2 लीटर फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) 7.4 पीएच के खिलाफ लोमो और पीपी नमूने 3 बार Dialyze. 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी dialyzing कदम प्रदर्शन
- 14,000 XG पर नमूना 10 मिनट अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला युक्त लोमो या HSA के लिए संयुग्मित पीपी इकट्ठा.
- एक एसडीएस पृष्ठ के प्रदर्शन से प्रोटीन के लिए सतह पर तैरनेवाला की जाँच करें, जैल 12% का उपयोग कर. HSA संयुग्म के 12 μg के बारे में एक जेल स्लॉट में लोड करें.
2. दवा conjugates के युग्मन दर (चित्रा 2) निर्धारित
- HPSEC द्वारा लोमो और पीपी conjugates के युग्मन दर के विश्लेषण के लिए एक 100 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर 6.5 पीएच 150 मिमी NaCl और 0.05% सोडियम azide युक्त का उपयोग करें. एक 7.8 x 300 का प्रयोग करें TSK जेल-G2000 SWXL स्तंभ मिमी.
- एक ऑनलाइन मिलकर आरआई और यूवी डिटेक्तार प्रणाली का उपयोग करके संकेतों का पता लगाने का प्रदर्शन.
- DH ओ 2 में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के साथ एक HSA मानक नमूना तैयार डिटेक्टर अंशांकन के लिए 50 μl HSA मानक समाधान इंजेक्षन.
- आरआई निरंतर कश्मीर आरआई और यूवी के लिए निरंतर कश्मीर यूवी डिटेक्टर की गणना . सूत्रों का प्रयोग करें क्षेत्र आरआई k = आरआई * [(dn डीसी /) HSA * ग (HSA)] और क्षेत्र यूवी k = यूवी * [(डीए डीसी /) HSA * (HSA) ग] के साथ (/ dn डीसी) HSA = 0.185 और (डीए / डीसी) HSA 0.518 = 5.
- लोमो और HPSEC के लिए पीपी व्युत्पन्न मानकों है कि दोनों मानकों के 5, 10, और 30 nmol मात्रा को आसानी से इंजेक्शन जा सकता है तैयार.
- (Dn / डीसी) दवा और दोनों मानकों के लिए (/ डीए डीसी) दवा के लिए मूल्यों मतलब है की गणना. लोमो, (dn / डीसी) 0.235 0.010 ± और (/ डीए डीसी) के 39.000 ± 0.493 निर्धारित किया गया था. पीपी के लिए, 0.328 ± 0.016 (dn / डीसी) और (/ डीए डीसी) के 53.155 ± 2.464 निर्धारित किया गया था.
- HPSEC पर दवा conjugates इंजेक्षन और उनके आरआई और यूवी चोटी क्षेत्रों का निर्धारण.
- दो समीकरणों क्षेत्र = आरआई कश्मीर * [(dn डीसी /) दवा * ग (दवा) + (/ dn डीसी) HSA * ग (HSA)] क्षेत्र और यूवी आरआई को हल करके लोमो, पीपी व्युत्पन्न, और HSA की एकाग्रता की गणना k = यूवी * [(डीए डीसी /) दवा * ग (दवा) + (डीए / डीसी) HSA * ग (HSA)] अज्ञात के लिए.
3. दवा बैट का उपयोग conjugates
- सात प्रवाह cytometry शीशियों की तैयारी और उन्हें अपनी सामग्री पर निर्भर करता है: बेदाग नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण, और दवा conjugates लेबल.
- पिपेट बी सीसीआर - STB बेदाग और नकारात्मक नियंत्रण के लिए आरक्षित शीशियों में उत्तेजना बफर (Flow2 कास्ट, Bühlmann प्रयोगशालाओं, Schönenbuch, दर्पण) के 50 μl. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक विरोधी FcεRI Flow2 कास्ट किट द्वारा प्रदान समाधान के 50 μl का उपयोग करें. 0.02 -20 μg / एमएल लोमो संयुग्म और पीपी संयुग्म (200 μl की परख मात्रा में अंतिम सांद्रता) से 1:10 कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने के द्वारा दवा conjugates के लिए आरक्षित शीशियों संयुग्म समाधान का उचित मात्रा में जोड़ें. ये अनुमापन प्रयोगों के लिए प्रत्येक रोगी के नमूने के लिए इष्टतम बेसोफिल सक्रियण की एकाग्रता का निर्धारण किया जाना चाहिए.
- प्रत्येक ट्यूब और 50 μl मरीज EDTA पूरे रक्त 100 μl उत्तेजना बफर जोड़ें. ध्यान से नमूने मिक्स.
- पिपेट 20 μl Flow2 कास्ट धुंधला विरोधी CCR3 phycoerythrin (पीई) और विरोधी CD63 fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ एक ट्यूब के लिए लेबल एंटीबॉडी के साथ लेबल एंटीबॉडी युक्त अभिकर्मक और फिर मिश्रण. बेदाग नमूना में धुंधला अभिकर्मक विंदुक मत करो!
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 45 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया बंद करो.
- प्रत्येक शीशी और भंवर धीरे 2.0 मिलीलीटर Flow2 कास्ट lysing अभिकर्मक जोड़कर एरिथ्रोसाइट्स lyse. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में नमूने सेते हैं.
- 500 XG पर 5 मिनट और ध्यान से छानना सतह पर तैरनेवाला के लिए नमूने अपकेंद्रित्र.
- 500 μl कास्ट Flow2 धोने और प्रवाह cytometry तक बर्फ पर बफर दुकान में कोशिकाओं Resuspend.
- प्रवाह है कोशिकामापी वोल्टेज एस समायोजित करेंआगे और पक्ष तितर बितर (FSC, एसएससी) के लिए ettings जबकि बेदाग नमूना प्राप्त है.
- गेट कोशिकाओं एसएससी-FSC एसएससी - पीई साजिश साजिश से लिम्फोसाइटों के रूप में भविष्यवाणी की. Basophils पीई लेबल CCR3 हाय एसएससी लो और उन्हें FITC - पीई साजिश में गेट के रूप में विरोधी CCR3 एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाते हैं. विरोधी CD63 सक्रिय basophils का पता लगाने के एंटीबॉडी FITC के साथ लेबल है.
- अधिकतम करने के लिए कट ऑफ नकारात्मक नियंत्रण में हाय CD63 के रूप में 2.5% basophils के सेट. एक नमूना बेसोफिल सक्रियण के लिए सकारात्मक माना जाता है अगर> 5% basophils हाय CD63 और नकारात्मक नियंत्रण के एमएफआई द्वारा विभाजित नमूना का मतलब प्रतिदीप्ति (एमएफआई) सूचकांक 2 से अधिक है (चित्रा 3).
4. प्रतिनिधि परिणाम:
यह प्रयोग एक लाभदायक IgE निर्भर दवा hypersensitivity का पता लगाने के उपकरण के रूप में बैट मूल्यांकन करता है. NSAIDs के प्रोटीन conjugates basophils के सक्रियण के लिए उपयोग किया जाता है. HPSEC करके आरआई और यूवी का पता लगाने के एकत्रीकरण राज्य, युग्मन डिग्री, और conjugates के प्रभावी उपज के साथ निर्धारित कर रहे हैं. चित्रा 4 शो के रूप में, लोमो conjugates के 43.5% 5.0 लोमो / HSA की युग्मन डिग्री के साथ monomeric बने रहे. समुच्चय के लिए 9.5 की एक युग्मन डिग्री निर्धारित किया गया था. propyphenazone संयुग्म 21.2 के एक युग्मन की डिग्री के साथ 68.5% monomers के मिलकर दिखाया गया था. समुच्चय के युग्मन डिग्री 27.9 था. कुल में, लोमो conjugates निर्धारित युग्मन डिग्री 7.6 लोमो और पीपी conjugates की 23.2 था.
बैट अनुकूलित (conjugates की एकाग्रता, उत्तेजना समय) NSAID hypersensitivity में IgE निर्भर प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति शर्तों के तहत conjugates के साथ प्रदर्शन किया. Basophils के 20.6% सक्रिय थे प्रतिदीप्ति तीव्रता में लॉग शिफ्ट द्वारा विशेषता: के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है, केवल पीपी संयुग्म ट्रिगर बेसोफिल सक्रियण CD63 सतह अभिव्यक्ति में एक upregulation द्वारा कल्पना करने में सक्षम था. एमएफआई 386 (नकारात्मक नियंत्रण) से 4.9 का एक पहलू से 1893 की वृद्धि हुई. इसके विपरीत, लोमो संयुग्म basophils का केवल 3.1% का उपयोग सक्रिय थे जो 5% कट ऑफ नीचे था. इसके अलावा एमएफआई केवल एक 1.1 कारक (2.0 सीमा) से वृद्धि हुई 210 से 197 (नकारात्मक नियंत्रण). परख वैधता द्वारा दिया जाता है (मैं) <5% नकारात्मक नियंत्रण में बेसोफिल सक्रियण, (ii) एक बेसोफिल subpopulation के प्रतिदीप्ति तीव्रता में लॉग - पाली, और (iii)> 50% सक्रिय basophils (सकारात्मक नियंत्रण).
चित्रा 1 लोमो और पीपी व्युत्पन्न के HSA के लिए युग्मन. भंग के बाद दवाओं, पानी, एमईएस बफर, और EDC (युग्मन अभिकर्मक) जोड़ रहे हैं. नमूने 1 मिनट के लिए vortexed हैं पहले HSA दवा समाधान के लिए pipetted है. 2 कमरे के तापमान पर मिलाते घंटे के भीतर दवाओं covalently HSA करने के लिए बाध्य है. समुच्चय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से monomers परिणाम हो सकता है.
चित्रा 2 युग्मन डिग्री की गणना. सबसे पहले, आरआई और कश्मीर यूवी कश्मीर स्थिरांक निर्धारित कर रहे हैं . इसलिए, ज्ञात एकाग्रता के साथ HSA मानक HPSEC प्रणाली में अंतःक्षिप्त है. (/ Dn डीसी) और (डीए / डीसी) HSA की 0.185 और 0.518 के मान दिया जाता है, क्रमशः 5. चोटी क्षेत्रों स्थिरांक की गणना के लिए इस्तेमाल किया जाता है. दूसरा, प्रत्येक दवा के लिए तीन मानकों करने के लिए दवा और एकाग्रता विशेष आरआई और यूवी क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए अंतःक्षिप्त रहे हैं. के बाद से कश्मीर आरआई और कश्मीर यूवी स्थिरांक उपरोक्त कदम से जाना जाता है, डेरिवेटिव दवा विशिष्ट (dn / डीसी) और (डीए / डीसी) की गणना की जा सकती है. तीसरा, दवा HSA conjugates HPSEC में अंतःक्षिप्त रहे हैं. परिणामस्वरूप शिखर क्षेत्रों में दो अज्ञात चर के साथ दो समीकरण को हल करके शिखर प्रति दवा और HSA की सांद्रता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है.
चित्रा 3 बेसोफिल gating. कक्ष की भविष्यवाणी के रूप लिम्फोसाइटों आगे तितर बितर बनाम gated पक्ष तितर बितर (एसएससी FSC साजिश). basophils CCR3 हाय एसएससी लो के रूप में gated लिम्फोसाइटों (एसएससी - CCR3 पीई साजिश) से पहचाने जाते हैं. Basophils CD63 FITC - CCR3 पीई साजिश में सक्रियण (CD63 हाय) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं . नकारात्मक नियंत्रण के लिए अधिकतम 2.5% CD63 हाय शेष basophils की कटौती बंद सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 4 निश्चय दवा conjugates के युग्मन डिग्री. आरआई और यूवी संकेतों दो चोटियों (प्रतिधारण कम मात्रा में eluting) और दवा HSA conjugates के समुच्चय monomers (उच्च प्रतिधारण मात्रा में eluting) का प्रतिनिधित्व दिखा. Monomers और समुच्चय के प्रतिशत (आरआई संकेतों से निर्धारित) और उनके युग्मन डिग्री (n = 1) चित्रित कर रहे हैं.
चित्रा 5 बेसोफिल activati.परीक्षण पर. संयुग्म सक्रिय दवा के नमूने, नकारात्मक नियंत्रण, और सकारात्मक नियंत्रण के परिणाम CD63 FITC - CCR3 पीई भूखंडों (n = 1) में दिखाए जाते हैं.
Discussion
बैट है एक अच्छी तरह से स्थापित हालांकि नहीं अभी तक नियमित रूप से IgE की मध्यस्थता एलर्जी 6,7 रोग के निदान के लिए विधि का इस्तेमाल किया. दवा hypersensitivity के लिए, तथापि, इसके लागू के रूप में कम आणविक भार यौगिकों crosslink IgE रिसेप्टर्स, बेसोफिल 8 सक्रियण के लिए एक शर्त करने में सक्षम नहीं हैं समझौता किया है. इसलिए, जांच के तहत दवाओं covalently उपयुक्त वाहक प्रोटीन (जैसे HSA) करने के लिए युग्मित किया जा जरूरत है. महत्वपूर्ण बात, युग्मन डिग्री (यानी प्रति वाहक प्रोटीन दवा अणुओं की संख्या) conjugates के प्रतिरक्षाविज्ञानी गतिविधि (यानी IgE पार से जोड़ने रिसेप्टर) की गारंटी करने के लिए नियंत्रित किया जा जरूरत है. सिद्धांततः, वाहक अणु प्रति दो haptens IgE रिसेप्टर के लिए पर्याप्त होना चाहिए पार से जोड़ने और के रूप में पांच HSA प्रति लोमो अणुओं के रूप में कुछ के लिए एक सेल आधारित परख में 4 मध्यस्थ रिहाई को ट्रिगर करने के लिए दिखाया गया है. दोनों conjugates, पीपी HSA और DF-HSA, एक पर्याप्त उच्च युग्मन डिग्री (HPSEC) प्रदर्शन और immunologically सक्रिय हो उन्हें बैट में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त अभिकर्मकों बनाने के लिए निर्धारित किया गया है. एक और मुद्दा है कि दवा चयापचयों एक भूमिका निभा सकते हो, माता पिता दवा के बजाय एक metabolite के रूप में hypersensitivity प्रतिक्रिया का कारण हो सकता है हो सकता है. लोमो के मामले में, इस संभावना के विस्तार में पहले पांच प्रमुख चरण मैं चयापचयों और एक उठाना 4 संस्करण का उपयोग मूल्यांकन किया गया है. वर्णित तकनीक mastering के लिए महत्वपूर्ण कारकों में रक्त नमूना (<रक्त संग्रह, पता चला basophils की संख्या के बाद से 12 घंटे> 500) और उत्तेजना शर्तों के अनुकूलन (समय, खुराक,) की गुणवत्ता में शामिल हैं. इसके अलावा, गैर responders के जो भी सकारात्मक नियंत्रण (एंटीबॉडी IgE रिसेप्टर के खिलाफ निर्देशित) की पहचान की जा के साथ प्रतिक्रिया नहीं है तथाकथित. इसलिए, मान्यता मानदंड सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक विरोधी FcεRI एंटीबॉडी शामिल है. दवा conjugates का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ यह तथ्य है कि वे गैर विषैले शुद्ध दवाओं, के रूप में विरोधी FcεRI बैट 4 में एंटीबॉडी के साथ सह उत्तेजना के द्वारा संयुग्म DF-HSA के लिए दिखाया के विपरीत दिखाई है. शुद्ध लोमो, इसके विपरीत में, 1.25 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में साइटोटोक्सिक प्रभाव को प्रदर्शित करता है विवेचनीयता के 9 बैट के साथ समस्याओं के कारण. आम तौर पर, संभावित cytotoxicity के लिए परीक्षण दृढ़ता से हर नव निर्मित दवा संयुग्म के लिए सिफारिश की है.
यहाँ, हम पीपी-HSA संयुग्म IgE-मध्यस्थता hypersensitivity प्रकट बैट में इस्तेमाल की क्षमता से पता चला है. इसके विपरीत, लोमो hypersensitivity संयुग्म लोमो - HSA के जवाब में बेसोफिल सक्रियण की कमी के द्वारा प्रदर्शन IgE के साथ संबद्ध नहीं है. महत्वपूर्ण बात, एक IgE की मध्यस्थता तंत्र के विषय में अनिश्चितता के मामले में, conjugates प्रतिरक्षाविज्ञानी गतिविधि के लिए इन विट्रो सेल आधारित परख प्रणालियों में मूल्यांकन के रूप में 4 लोमो के लिए दिखाया गया है.
कम आणविक भार दवाओं conjugating उपयुक्त प्रोटीन वाहक covalently वर्णित सेटअप का उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं सहित दवाओं, अन्य NSAIDs, radiocontrast मीडिया, मांसपेशियों को ढीला, anesthetics के खिलाफ hypersensitivity प्रतिक्रियाओं के एक नंबर अणु, आदि एक IgE की मध्यस्थता की भागीदारी के लिए जांच की जा सकती है तंत्र. इसलिए, बैट (त्वचा परीक्षण, मौखिक उकसाव परीक्षण) निदान के लिए मौजूदा तरीकों के लिए एक अतिरिक्त के रूप में में सेवा कर सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF) अनुदान P18820-B13 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
आचार बयान:
अध्ययन (PLUS_Ethik_090514) Salzburg के विश्वविद्यालय में प्रयोगों से मनुष्य और / या पशु का सहयोग हेलसिंकी Declaraction के साथ पालन के रूप में 1983 में संशोधित और सभी भाग लेने वाले रोगियों को उनके लिखित सूचित सहमति दे दी है के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Bench top centrifuge | Sigma-Aldrich | - | - |
| Diclofenac sodium salt | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett-Packard | - | - |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | - | - |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | - |
| Propyphenazone derivative | University of Salzburg | - | - |
| Shaker | Eppendorf | - | - |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Sodium hydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | - |
References
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