Summary
Базофилов активации теста является мощным инструментом для выявления IgE-зависимой аллергии
Abstract
Аллергические реакции на нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), как propyphenazone (ПП) и диклофенака (DF) могут проявляться как тип I типа аллергических реакций 1. В клинической практике диагноз лекарственной чувствительности в основном выполняются пациента истории, как кожная проба не является надежным и устного тестирования провокация медведи опасных для жизни риск для пациента 2. Таким образом, доказательство основной IgE-опосредованной pathomechanism трудно получить.
Здесь мы представляем в пробирке метод, основанный на использовании человеческих базофилов, полученных от незаконного-сверхчувствительных пациентов, который имитирует аллергические реакции эффектора в естественных условиях. Как базофилов лекарственно-аллергических больных нести IgE молекулы, специфичные для виновника наркотики, они становятся активируется при сшивания рецептор IgE и отпустите аллергические эффекторных молекул. Активация базофилов могут контролироваться с помощью определения регуляция CD63 поверхности выражения с помощью проточной цитометрии 3.
В случае низкого молекулярного веса наркотиков, конъюгаты которые созданы для IgE рецепторов сшивания на базофилы. Как показано на рисунке 1, двух представителей НПВП, РР и DF, ковалентно связаны с сывороточного альбумина человека (HSA) через карбоксильную группу, реагирующих с первичной аминогруппы остатков лизина. DF осуществляет внутреннюю карбоксильной группы и, таким образом, могут быть использованы непосредственно 4, тогда как карбоксильная группа содержащих производные ПП должно было быть синтезированы organochemically до исследования 1.
Связь степени низкомолекулярных соединений на молекулы белка-носителя и их пространственного распределения важно гарантировать сшивание двух молекул IgE рецептором. Описанный здесь протокол применяется высокопроизводительный-гель-хроматографии (HPSEC), оснащенный последовательным показателем преломления (RI) и ультрафиолетового (УФ) система обнаружения для определения степени связи.
Как описано методика может быть применена для других препаратов, тест активации базофилов (БАТ) несет потенциально могут быть использованы для определения IgE-опосредованные механизмы наркотиков гиперчувствительности. Здесь мы определяем ПП гиперчувствительности как IgE-опосредованной гиперчувствительности и DF, как не-IgE-опосредованной по НДТ.
Protocol
1. Подготовка наркотиков конъюгатов
- Растворите 10 мг DF в 1 мл дН 2 O в 1,5 трубки реакции мл. В дальнейшем исходя использовать 95 мкл этого DF решение. Для сопряженных PP для HSA растворить 30,4 мг PP производные (304 г / моль) в 500 мкл 0,3 М раствора гидроксида натрия (NaOH).
- Добавить 430,6 мкл дН 2 O и 100 мкл 0,5 М 2 - (N-морфолино) этансульфоновая кислоты (MES) буфера рН 6,5 до 95 мкл растворенных DF. Добавить 33,1 мкл дН 2 O и 140 мкл 2 М MES буфера рН 2,9 до образцов ПП.
- Добавить 57,5 мкл свежеприготовленного N-этил-N '- (3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид (EDC) маточного раствора, растворенного в дН 2 O с концентрацией 100 мг / мл до образца DF, или 10 мкл раствора EDC для образец ПП. Vortex образцы в течение 1 минуты.
- Добавить 16,9 мкл раствора HSA с концентрацией 118 мг / мл до каждого образца.
- Инкубируйте образцы в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании на 300 выстрелов / мин.
- Диализировать DF и PP образцов 3 раза по сравнению с 2 литра фосфатно-солевом буфере (PBS) рН 7,4 в течение нескольких часов каждый. Выполните все шаги диализа при 4 ° C.
- Центрифуга образца 10 минут при 14 000 мкг и собирают супернатант, содержащий DF или ПП конъюгированных с HSA.
- Проверьте супернатант для белков, выполняя SDS-PAGE, используя 12% гелей. Нагрузка около 12 мкг HSA сопряженных в одну гель слот.
2. Определите скорость связи наркотиков конъюгатов (рис. 2)
- Для анализа связи скорость DF и PP конъюгатов по HPSEC использовать 100 мМ натрий-фосфатного буфера рН 6,5, содержащего 150 мМ NaCl и 0,05% азида натрия. Используйте 7,8 х 300 мм, TSK-гель-G2000 SWXL колонке.
- Выполнить обнаружение сигналов с помощью онлайн-связанной РИ и системы УФ-детектор.
- Подготовка HSA стандартного образца с концентрацией 1 мг / мл в дН 2 O. Для калибровки детекторов вводят 50 мкл HSA стандартное решение.
- Рассчитать Р. Р. постоянной А и УФ постоянной УФ к для детектора. Использование формулы Р. И. площадь = к RI * [(дп / постоянного тока) * с HSA (ЧСА)] и области УФ = к УФ * [(DA / постоянного тока) * с HSA (ЧСА)] с (дп / постоянного тока) HSA = 0,185 и (дА / постоянного тока) HSA = 0,518 5.
- Подготовка DF и PP производные стандарты HPSEC, что 5, 10 и 30 нмоль количества обоих стандартов могут быть легко введены.
- Рассчитать средние значения (дп / постоянного тока) и наркотиков (DA / DC), препарат для обоих стандартов. Для DF, (дп / постоянного тока) от 0,235 ± 0,010 и (DA / постоянного тока) от 39,000 ± 0,493 определялась. Для ПП, (дп / постоянного тока) от 0,328 ± 0,016 и (DA / постоянного тока) от 53,155 ± 2,464 определялась.
- Inject наркотиков конъюгатов на HPSEC и определить их РИ и УФ площадей пиков.
- Рассчитайте концентрацию DF, ПП производной, и АСП, решая два уравнения площадь Р. = к RI * [(дп / постоянного тока) * с наркотиками (наркотиками) + (дп / постоянного тока) * с HSA (ЧСА)] и УФ-области = к УФ * [(DA / постоянного тока) * с наркотиками (наркотиками) + (дА / постоянного тока) * с HSA (ЧСА)] для неизвестных.
3. BAT использованием наркотиков конъюгатов
- Подготовка семь чаш проточной цитометрии и маркировать их в зависимости от их содержания: неокрашенных контроля, отрицательного контроля, положительного контроля и наркотиков конъюгатов.
- 50 мкл B-CCR-СТБ стимуляция буфера (производительности2 CAST, Бюльман Laboratories, Schönenbuch, CH) в флаконах зарезервированы для неокрашенных и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля, использовать 50 мкл анти-FcεRI решение предоставляемые производительности2 CAST комплект. Добавить соответствующее количество сопряженных решение флаконах зарезервированы для наркотиков конъюгатов, создав серию разбавлении 1:10 от 0,02 -20 мкг / мл DF сопряженных и ПП сопряженных (конечная концентрация в анализе объеме 200 мкл). Эти эксперименты титрования должны быть выполнены, чтобы определить концентрацию оптимальной активации базофилов для каждого пациента образца.
- Добавить 100 мкл буфера для стимуляции в каждую пробирку и ЭДТА 50 мкл пациента цельной крови. Смешайте образцы тщательно.
- Внесите 20 мкл производительности2 CAST окрашивания реагентов, содержащих противопехотные CCR3 антител, меченных фикоэритрин (PE) и анти-CD63 антител, меченных флуоресцентной изотиоцианат (FITC) в каждую пробирку и снова перемешать. Не пипетки окрашивания реагента в неокрашенных образцов!
- Инкубируйте образцы в течение 45 минут при 37 ° С водяной бане.
- Остановить реакцию на льду в течение 5 минут.
- Lyse эритроцитов, добавляя 2,0 мл топлива 2 CAST лизирующего реагента для каждого флакона и вихревые мягко. Инкубируйте образцы в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Центрифуга образцы в течение 5 минут при 500 мкг и тщательно сцеживать супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера производительности2 CAST мыть и хранить на льду, пока проточной цитометрии.
- Отрегулируйте напряжение с потоком цитометр вettings для прямого и бокового рассеяния (FSC, SSC) при приобретении неокрашенных образцов.
- Ворота клетки предсказать, как лимфоциты SSC-ФСБ заговор с целью SSC-PE сюжет. Базофилы идентифицируются PE меченные анти-антитело, как CCR3 CCR3 привет SSC вот и ворота их в FITC-PE сюжет. Анти-CD63 антител обнаружения активированных базофилов помечена FITC.
- Установить светотеневой границы, не более 2,5% базофилов, как CD63 привет в отрицательного контроля. Проба считается положительной для активации базофилов, если> 5% базофилов CD63 привет и средний индекс флуоресценции (МФО) образца, деленная на МФО отрицательного контроля превышает 2 (рис. 3).
4. Представитель Результаты:
Этот эксперимент оценивает НИМ, полезным инструментом для выявления IgE-зависимых наркотиками гиперчувствительности. Белки конъюгатов НПВП используются для активации базофилов. По HPSEC с РИ и УФ-детектированием агрегатного состояния, степени связи и эффективного выхода конъюгатов определены. Как показано на рисунке 4 показывает, 43,5% конъюгатов DF остался мономерных с связи степень 5,0 DF / HSA. Для агрегатов связи степень 9,5 было определено. Propyphenazone сопряженных было показано, что состоят из 68,5% мономеров с муфта степени 21,2. Связь степени агрегатов 27.9. В целом, определяется связью степень конъюгатов DF составил 7,6 DF и сопряженных ПП составила 23,2.
БАТ осуществляется с сопряженными в оптимальных условиях (концентрация конъюгатов, стимулирование времени) позволило исследование IgE-зависимых реакций гиперчувствительности на НПВП. Как показано на рисунке 5, только ПП сопряженных смог вызвать активацию базофилов визуализируется регуляция в CD63 поверхности выражение: 20,6% базофилы были активированы характеризуется лог-сдвиг в интенсивности флуоресценции. МФО увеличился на коэффициент 4,9 от 386 (отрицательный контроль) в 1893 году. В противоположность этому, использование DF сопряженных только 3,1% базофилы были активированы которая была ниже 5% отсечки. Кроме того, МФО увеличился всего на коэффициент 1,1 (предел 2,0) от 197 (отрицательный контроль) до 210. Анализ действия определяется формулой (я) <5% базофилов активации в отрицательном контроле, (II) лог-сдвиг в интенсивности флуоресценции базофилов субпопуляции, и (III)> 50% активированных базофилов (положительный контроль).
Рисунок 1. Взаимодействие производных DF и НД HSA. После растворения лекарства, воду, МЧС буфер, и EDC (муфта реагента) добавляются. Образцы встряхивали в течение 1 минуты, прежде чем HSA является пипеткой к препарату решений. В течение 2 часов тряски при комнатной температуре препараты ковалентно связываются с HSA. Мономеры, а также агрегатов может привести.
Рисунок 2. Расчет связи градусов. Во-первых, постоянные к РИ и к УФ определены. Таким образом, HSA стандарт с известной концентрацией вводится система HPSEC. (Дп / постоянного тока) и (дА / DC) из HSA приведены значения 0,185 и 0,518, соответственно, 5. Площадей пиков используются для расчета констант. Во-вторых, для каждого препарата три стандарта вводятся для определения наркотиков и концентрации конкретных РИ и УФ областях. Так как Р. И. К и константы к УФ известны из описанных выше шагов, наркотиков конкретные (дп / постоянного тока) и (дА / постоянного тока) производные могут быть вычислены. В-третьих, наркотики HSA конъюгатов вводятся в HPSEC. В результате областях пик используются для расчета концентрации наркотиков и HSA на пик при решении двух уравнений с двумя неизвестными.
Рисунок 3. Базофилов стробирования. Клетки предсказать, как лимфоциты закрытого разброс сторону по сравнению вперед рассеяния (SSC-ФСБ участка). Базофилы определены как CCR3 привет SSC вот из закрытого лимфоцитов (SSC-CCR3-PE участка). Базофилы анализируются для активации (CD63 привет) в CD63-FITC-CCR3-PE сюжет. Отрицательный контроль используется для установки отсечки не более 2,5% базофилы оставшиеся CD63 привет.
Рисунок 4. Преисполнен связи градусов наркотиков конъюгатов. RI-и УФ-сигналы показывают два пика представляющие агрегаты (элюированием при низкой громкости удержание) и мономеров (элюированием при высоком уровне громкости удержание) лекарственно-HSA конъюгатов. Проценты мономеров и агрегаты (определяется по Р. сигналов) и их связь градусов изображены (п = 1).
Рисунок 5. Базофилов activatiна тест. Результаты наркотиков сопряженных активированных образцов, отрицательного контроля и положительного контроля приведены в CD63-FITC-CCR3-PE участков (п = 1).
Discussion
НДТ устоявшихся хотя пока еще не широко используется метод диагностики IgE-опосредованные аллергические заболевания 6,7. Для приготовления гиперчувствительность, однако, возможность его применения снизился в низкомолекулярных соединений не в состоянии сшивки IgE рецепторов, предпосылкой для активации базофилов 8. Таким образом, препараты при расследовании должны быть ковалентно связаны с белками подходящий носитель (например, HSA). Важно отметить, что степень связи (т.е. количество наркотиков молекул на белок-носитель) должна находиться под контролем, чтобы гарантировать иммунологическую активность (т.е. IgE рецепторов сшивания) конъюгатов. Теоретически, два гаптенов за молекулой-носителем должна быть достаточной для рецепторов IgE сшивания и всего лишь пять DF молекул в HSA, как было показано, чтобы вызвать посредника выпуска в клеточной анализа 4. Оба конъюгатов, ПП-HSA и DF-HSA, были определены для отображения достаточно высокой степенью связи (HPSEC) и быть иммунологически активных делает их пригодными для использования реагентов в НИМ. Еще один вопрос, может быть, метаболитов наркотиков может играть роль, так как метаболита вместо исходного препарата может вызвать реакции гиперчувствительности. В случае DF, эта возможность была оценена подробно ранее с помощью пяти основных этапа I метаболитов и одна связь вариант 4. Важными факторами для освоения Описанная методика включает качество крови (<12 часов с момента забора крови, количество обнаруженных базофилов> 500) и оптимизации стимуляции условий (время, доза). Кроме того, так называемые, отказавшихся отвечать, которые даже не вступают в реакцию с положительным контролем (антитела, направленные против рецепторов IgE), должны быть идентифицированы. Таким образом, проверка критериев для включения анти-FcεRI антител в качестве положительного контроля. Важным преимуществом использования наркотиков конъюгатов является тот факт, что они появляются нетоксичным в отличие от чистых препаратов, как показано на DF-HSA сопряжены совместной стимуляции анти-FcεRI антител в BAT 4. Чистая DF, напротив, показывает цитотоксических эффектов при концентрации 1,25 мг / мл, возникают проблемы со интерпретируемости BAT 9. Как правило, тестирование для потенциальных цитотоксичность настоятельно рекомендуется для всех вновь произведенных наркотиков сопряжены.
Здесь мы показали потенциал PP-HSA сопряженных использоваться в BAT выявить IgE-опосредованной гиперчувствительности. В отличие от DF гиперчувствительности не связан с IgE свидетельствует отсутствие активации базофилов в ответ на DF-HSA сопряжены. Важно отметить, что в случае неопределенности в отношении IgE-опосредованной механизм, конъюгаты должны быть обследованы на иммунологическую активность в пробирке клеточных систем на основе анализа, как это было показано для DF 4.
Использование описанной установки сопряжения низкомолекулярные препараты вес ковалентно подходящим носителем белковых молекул число реакций гиперчувствительности против наркотиков в том числе антибиотиков, других НПВС, радиоконтрастного СМИ, миорелаксанты, анестетики и т.д., могут быть исследованы для участия IgE-опосредованной механизм. Таким образом, БАТ может служить дополнением к существующим методам диагностики (кожный тест, устное тестирование провокация).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Австрийского фонда науки (ПВ) грант P18820-B13.
Этика заявление:
Исследование было одобрено (PLUS_Ethik_090514) в Комитет по этике для экспериментов с участием людей и / или животных в Университете Зальцбурга соблюдения Declaraction Хельсинки в редакции 1983 года и всех пациентов, участвующих дал свое письменное информированное согласие.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Bench top centrifuge | Sigma-Aldrich | - | - |
| Diclofenac sodium salt | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett-Packard | - | - |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | - | - |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | - |
| Propyphenazone derivative | University of Salzburg | - | - |
| Shaker | Eppendorf | - | - |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Sodium hydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | - |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
