Summary
Basophil aktivering test är ett kraftfullt verktyg för detektering av IgE-beroende allergier
Abstract
Överkänslighetsreaktioner mot icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) som Propyphenazone (PP) och diklofenak (DF) kan visa sig som typ I-liknande allergiska reaktioner 1. I klinisk praxis är diagnos av drog överkänslighet i huvudsak utförs av patientens historia, hudtest inte tillförlitliga och oral provokation björnar livshotande risker för patienten 2. Därför är bevis för en bakomliggande IgE-medierad pathomechanism svårt att få.
Här presenterar vi ett in vitro-metod bygger på användning av mänskliga basofiler från narkotika-överkänsliga patienter som efterliknar den allergiska effektor reaktion in vivo. Som basofiler av drog-allergiska patienter bär IgE-molekyler är specifika för den skyldige drogen blir de aktiveras vid IgE-receptorn crosslinking och släpp allergiska effektor molekyler. Aktivering av basofiler kan övervakas genom bestämning av uppreglering av CD63 yta uttryck med hjälp av flödescytometri 3.
Vid lågmolekylära läkemedel, är konjugat utformats för att IgE-receptorn crosslinking på basofiler. Som visas i Figur 1, två representanter för NSAID, PP och DF är kovalent bundet till humant serumalbumin (HSA) via en karboxylgrupp reagerar med primär aminogrupp av lysin rester. DF bär en inneboende karboxylgrupp och därmed kan användas direkt 4, medan en karboxylgrupp som innehåller derivat av PP måste organochemically syntetiseras före studien 1.
Kopplingen Graden av lågmolekylära föreningar på proteinet bärare molekylen och deras geografiska spridning är viktigt att garantera crosslinking av två IgE-receptorn molekyler. Den här beskrivna protokollet gäller högpresterande storlek uteslutning kromatografi (HPSEC) utrustad med en sekventiell brytningsindex (RI) och ultraviolett (UV) detekteringssystem för bestämning av kopplingen grad.
Eftersom den beskrivna metoden kan tillämpas för andra droger, bär basophil aktivering test (BAT) potential att användas för bestämning av IgE-medierade mekanismer inom läkemedelsutveckling överkänslighet. Här konstateras PP överkänslighet som IgE-medierad och DF överkänslighet som icke-IgE-medierad av BAT.
Protocol
1. Beredning av läkemedel konjugat
- Lös 10 mg DF i 1 ml dH 2 O i ett 1,5 ml reaktionsrör. I den fortsatta förfarandet används 95 l av denna DF lösning. Att böja PP till HSA upplösa 30,4 mg PP derivat (304 g / mol) i 500 l 0,3 M natriumhydroxidlösning (NaOH).
- Tillsätt 430,6 l dH 2 O och 100 l 0,5 M 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES) buffert pH 6,5 till 95 l av lösta DF. Lägg till 33,1 l dH 2 O och 140 l 2 M MES buffert pH 2,9 till PP provet.
- Tillsätt 57,5 ìl av en nyligen beredd N-etyl-N "- (3-dimetylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) stamlösning upplöst i dH 2 O med en koncentration av 100 mg / ml till DF provet, eller 10 ìl EDC lösning PP provet. Vortex proverna i 1 minut.
- Tillsätt 16,9 ìl av HSA-lösning med en koncentration av 118 mg / ml till varje prov.
- Inkubera prov i 2 timmar i rumstemperatur under omskakning vid 300 skott / min.
- Dialyze DF och PP prover 3 gånger mot 2 liter fosfatbuffrad-saltlösning (PBS), pH 7,4 i flera timmar vardera. Utför alla dialyzing steg vid 4 ° C.
- Centrifugera provet 10 minuter vid 14.000 xgi och samla upp supernatanten med DF eller PP konjugerat till HSA.
- Kolla supernatanten för proteiner genom att utföra en SDS-PAGE, med 12% geler. Ladda om 12 mikrogram HSA konjugat till en gel kortplats.
2. Bestäm koppling hastighet av droger konjugat (figur 2)
- För analys av kopplingen graden av DF och PP-konjugat av HPSEC använda en 100 mm natrium pH fosfatbuffert 6,5 innehåller 150 mM NaCl och 0,05% natriumazid. Använd en 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 SWXL kolumn.
- Utför detektering av signaler via en online-kopplade RI och UV-detektor-system.
- Förbered en HSA standardprov med en koncentration av 1 mg / ml i dH 2 O. För detektor kalibrering injicera 50 l HSA standardlösning.
- Beräkna RI konstant k RI och UV konstant k UV för detektorn. Använd formlerna området RI = k RI * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] och området UV = k UV * [(DA / DC) HSA * c (HSA)] med (dn / dc) HSA = 0,185 och (DA / DC) HSA = 0,518 5.
- Förbered DF och PP derivat standarder för HPSEC att 5, 10 och 30 nmol mängder av båda standarderna lätt kan injiceras.
- Beräkna medelvärden för (dn / dc) drog och (DA / DC) läkemedel för båda standarderna. För DF, ett (dn / dc) på 0,235 ± 0,010 och en (DA / DC) av 39,000 ± 0,493 fastställdes. För PP, 2,464 A (dn / dc) av 0,328 ± 0,016 och en (DA / DC) av 53,155 ± fastställdes.
- Injicera drogen konjugat på HPSEC och bestämma deras RI-och UV-topp områden.
- Beräkna koncentrationen av DF, PP derivat och HSA genom att lösa de två ekvationerna området RI = k RI * [(dn / dc) drog * c (droger) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] och området UV = k UV * [(DA / DC) drog * c (droger) + (DA / DC) HSA * c (HSA)] för okända.
3. BAT att använda drogen konjugat
- Förbered sju skålarna flödescytometri och märka dem beroende på deras innehåll: ofärgade kontroll, negativ kontroll, positiv kontroll och konjugat drog.
- Pipettera 50 ìl av B-CCR-STB stimulering buffert (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) i flaskor reserverade för ofärgade och negativ kontroll. Som en positiv kontroll, användning 50 ìl av en anti-FcεRI lösning som Flow2 CAST kit. Tillsätt en lämplig mängd konjugat lösning till rören reserverade för läkemedlet konjugat genom att skapa en 1:10 spädningsserie från 0,02 -20 mikrogram / ml DF konjugat och PP-konjugat (slutkoncentrationer i en analys volym av 200 l). Dessa titrering experiment måste utföras för att bestämma koncentrationen av optimala basophil aktivering för varje patient prov.
- Tillsätt 100 l stimulans buffert i varje rör och 50 l patientens EDTA helblod. Blanda proverna noggrant.
- Pipettera 20 l Flow2 CAST färgning reagens som innehåller anti-CCR3 antikroppar märkta med fykoerytrin (PE) och anti-CD63 antikroppar märkta med fluorescein (FITC) till varje rör och blanda igen. Pipettera ej färgning reagens i ofärgade prov!
- Inkubera proverna i 45 minuter i 37 ° C vattenbad.
- Stoppa reaktionen på is i 5 minuter.
- Lyse erytrocyter genom att tillsätta 2,0 ml Flow2 CAST lyserings reagens till varje flaska och skaka försiktigt. Inkubera prov i mörker i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera prover i 5 minuter vid 500 xgi och försiktigt dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 500 l Flow2 CAST tvättbuffert och förvara på is tills flödescytometri.
- Justera flödescytometern spänning settings för framåt och sidospridning (FSC, SSC) medan förvärva ofärgade provet.
- Gate cellerna förutspådde så lymfocyter från SSC-FSC tomten till SSC-PE komplott. Basofiler identifieras av ett PE-märkt anti-CCR3 antikropp som CCR3 hi SSC lo och grind dem i FITC-PE komplott. Den anti-CD63-antikropp upptäcka aktiveras basofiler är märkt med FITC.
- Ställ cut-off till högst 2,5% av basofiler som CD63 hi i den negativa kontrollen. Ett prov betraktas som positivt för basophil aktivering om> 5% basofiler är CD63 hej och medelvärdet fluorescens index (MFI) i urvalet dividerat med MFI av den negativa kontrollen överstiger 2 (Figur 3).
4. Representativa resultat:
Detta experiment utvärderar BAT som ett bra verktyg för att upptäcka IgE-beroende drog överkänslighet. Protein konjugat av NSAID används för aktivering av basofiler. Genom HPSEC med RI-och UV-detektion aggregering staten, koppling examen och effektiva avkastning av konjugat bestäms. Som figur 4 visar, var 43,5% av DF konjugat monomera med en koppling grad av 5,0 DF / HSA. För aggregat en koppling grad av 9,5 fastställdes. Den Propyphenazone konjugat visade sig bestå av 68,5% monomerer med en koppling grad av 21,2. Kopplingen Graden av aggregaten var 27,9. Totalt var bestämd koppling graden av DF konjugat 7,6 DF och att PP konjugat var 23,2.
BAT utföras med konjugat i optimala förhållanden (koncentration av konjugat, stimulering tid) tillåts undersökning av IgE-beroende reaktioner i NSAID-överkänslighet. Som visas i figur 5, var bara PP konjugatet kunna utlösa basophil aktivering visualiseras genom en uppreglering av CD63 yta uttryck: 20,6% av basofiler aktiverades kännetecknas av en inloggning förändring fluorescensintensitet. MFI ökat med en faktor 4,9 från 386 (negativ kontroll) till 1893. I kontrast med hjälp av DF konjugatet endast 3,1% av basofiler aktiverades vilket var lägre än 5% cut-off. Även MFI ökade endast med en faktor 1,1 (gränsvärde 2,0) från 197 (negativ kontroll) till 210. Analysen giltighet ges av (i) <5% basophil aktivering i den negativa kontrollen, (ii) en logg-skifte i fluorescensintensitet en basophil delpopulation, och (iii)> 50% aktiverade basofiler (positiv kontroll).
Figur 1. Koppling av DF och PP derivat HSA. Efter upplösning av droger, vatten, MES buffert, och EDC (koppling reagens) läggs till. Proverna vortexed i 1 minut innan HSA är pipetteras till drogen lösningar. Inom 2 timmar skaka i rumstemperatur droger binder kovalent till HSA. Monomerer samt aggregat kan uppstå.
Figur 2. Beräkning av koppling grader. Först är de konstanter k RI: s och k UV fastställas. Därför är HSA standard med känd koncentration injiceras i HPSEC systemet. (Dn / dc) och (DA / DC) av HSA givna värden på 0,185 och 0,518, respektive 5. Toppen områden används för att beräkna konstanter. För det andra, för varje drog tre standarder injiceras för att bestämma narkotika-och koncentration specifika RI och områden UV. Eftersom k RI: s och k konstanter UV är kända från stegen ovan kan drogspecifika (dn / dc) och (DA / DC) derivat beräknas. Tredje, narkotika-HSA konjugat injiceras i HPSEC. Den resulterande toppareorna används för att beräkna koncentrationerna av läkemedlet och HSA per topp genom att lösa två ekvationer med två okända variabler.
Figur 3. Basophil gating. Celler förutspådde så lymfocyter gated Side Scatter kontra Forward Scatter (SSC-FSC plot). Den basofiler identifieras som CCR3 hi SSC lo från gated lymfocyter (SSC-CCR3-PE plot). Basofiler analyseras för aktivering (CD63 hi) i CD63-FITC-CCR3-PE komplott. Den negativa kontrollen används för att ställa cut-off på högst 2,5% basofiler återstående CD63 hej.
Figur 4. Fastställd koppling grader av läkemedel konjugat. RI och signaler UV visar två toppar som representerar aggregat (eluerande på låg retention volym) och monomerer (eluerar vid hög retentionsvolymen) av drog-HSA konjugat. Procent av monomerer och aggregat (bestämd från RI-signaler) och deras koppling examina avbildas (n = 1).
Figur 5. Basophil activatipå prov. Resultat av drogkonjugat-aktiverade prover, negativa kontroller, och positiva kontroller visas i CD63-FITC-CCR3-PE tomter (n = 1).
Discussion
BAT är en väl etablerad men ännu inte rutinmässigt använda metoden för diagnos av IgE-medierad allergisk sjukdom 6,7. För läkemedelsutveckling överkänslighet, men dess tillämpning äventyras som lågmolekylärt föreningar inte har möjlighet att Crosslink IgE-receptorer, en förutsättning för basophil aktivering 8. Därför droger under utredning måste kovalent kopplade till lämpliga bärarproteiner (t.ex. HSA). Viktigt behöver kopplingen examen (dvs. antal läkemedelsmolekyler per bärarprotein) som ska kontrolleras för att garantera immunologisk aktivitet (dvs. IgE receptorn bryggbindningen) av konjugat. Teoretiskt bör två haptener per bärare molekyl vara tillräckligt för IgE-receptorn tvärbindning och så få som fem DF molekyler per HSA har visat att utlösa medlare släppa i en cell-baserad analys 4. Båda konjugat, PP-HSA och DF-HSA, har fastställts för att visa en tillräckligt hög koppling examen (HPSEC) och att vara immunologiskt aktiva vilket gör dem lämpliga reagens för användning i BAT. En annan fråga kan vara att läkemedlet metaboliter kan spela en roll, som en metabolit istället för modersubstansen kan orsaka överkänslighet. Vid DF, har denna möjlighet utvärderats i detalj tidigare med hjälp av fem stora fas I-metaboliter och ett länkage variant 4. Viktiga faktorer för att kunna bemästra den beskrivna tekniken bland annat kvaliteten på blodprovet (<12 timmar sedan blodinsamling, antalet upptäckta basofiler> 500) och optimering av stimulering förutsättningar (tid, dos). Dessutom, så kallade icke-responders som inte ens reagera med den positiva kontrollen (antikropp riktad mot IgE-receptorn) måste identifieras. Därför validering kriterier måste inkludera ett anti-FcεRI antikropp som positiv kontroll. En viktig fördel med att använda droger konjugat är det faktum att de tycks giftfria i motsats till rena droger, som visas för DF-HSA konjugatet av samtidig stimulering med anti-FcεRI antikropp i BAT 4. Ren DF, däremot, visar cytotoxisk verkan vid en koncentration av 1,25 mg / ml orsaka problem med tolkningsbarhet av BAT 9. Generellt sett är testning för potentiell cytotoxicitet rekommenderas starkt för alla nyproducerade drogkonjugat.
Här har vi visat potentialen i PP-HSA-konjugat som används i BAT att avslöja IgE-medierad överkänslighet. Däremot är DF överkänslighet inte associerad med IgE påvisas av bristen på basophil aktivering som svar på DF-HSA konjugat. Viktigt vid osäkerhet om en IgE-medierad mekanism, konjugat måste utvärderas för immunologiska aktivitet genom in vitro cell-baserad analys system vilket har visats för DF 4.
Använda den beskrivna installationen av konjugera lågmolekylära läkemedel kovalent till lämpliga protein bärarmolekyler ett antal överkänslighetsreaktioner mot läkemedel inklusive antibiotika, andra NSAID radiocontrast media, muskelavslappnande medel, anestetika, etc. kan undersökas för en medverkan av en IgE-medierad mekanism. Därför kan BAT fungera som ett komplement till de befintliga metoderna för diagnos (hudtest, oral provokation).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av den österrikiska Science Fund (FWF) bevilja P18820-B13.
Etik uttalande:
Studien godkändes (PLUS_Ethik_090514) av den etiska kommittén för experiment som avser människor och / eller djur vid universitetet i Salzburg som uppfyller Helsingfors Declaraction som reviderades 1983 och alla patienter som deltar gav sitt skriftliga medgivande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Bench top centrifuge | Sigma-Aldrich | - | - |
| Diclofenac sodium salt | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett-Packard | - | - |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | - | - |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | - |
| Propyphenazone derivative | University of Salzburg | - | - |
| Shaker | Eppendorf | - | - |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Sodium hydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | - |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
