Summary
私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。
Abstract
日付に、適切なヒト心筋細胞源の欠如は、セルベースの移植によって、または心臓組織工学,1 - 3で、人間の心筋を再生させるの大きな後退要因となっている。心筋細胞は生後間もなく終末分化と増殖する能力を失うとなる。このような骨髄や臍帯血などの他のソースから派生した幹細胞/前駆細胞は、1-3心臓に移植後の収縮、心臓の筋肉細胞を生じさせることができるという証拠はない。損傷した心臓の筋肉を再生または修復する必要がある内因性または1-3細胞の配信を介してのいずれか、成体幹細胞治療によって満たされていない。遺伝的に安定したヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）を必要とする系統に制限されているヒト体細胞の大規模な供給のin vitroでの導出のための多能貯水池をproffering、無制限の拡張機能と無制限の可塑性を持っている修復と再生4,5の。心血管疾患の有病率ドナー臓器の全世界と深刻な不足のために、別のアプローチとして、ヒトES細胞ベースの治療法の開発に強い関心があります。しかし、所望の表現型に効率的かつ予測可能な多能性ヒトES細胞の広い分化能をチャネルする方法を発達研究と臨床の翻訳の両方にとって大きな課題となっています。従来のアプローチは、しばしば表現型の異質性と不安定性、それゆえ、腫瘍形成6-8のハイリスク（で回路図を参照して続いている非効率的で制御不能系統コミットメントの結果として、自発的な胚層の差別化による多能性幹細胞の多系統傾きに依存しています図1A）。さらに、定義されていない外国人/動物の生物学的なサプリメントおよび/または一般的に隔離、拡張、およびヒトES細胞の分化のために使用されているフィーダは、このような細胞specialiを直接使用することがあります9月11日 、問題のある患者でZED移植。これらの障害を克服するために、我々は臨床的に適切なヒトES細胞の de novo導出するためのプラットフォームとして、ヒトES細胞の胚盤葉上層のpluripotenceを維持するために必要かつ十分な定義培養系の要素を解決し、効果的に臨床的に意義のある系統に向かって一様にそのようなヒトES細胞を演出している小分子12（ 図1Bの回路図を参照）によって。小分子や増殖因子の様々なスクリーニングした後、我々はそのような定義された条件は、レンダリングされたニコチンアミド（NAM）、さらに高効率（ 図2と人間の拍動心筋細胞を生成cardioblastsに進んだ多能性ヒトES細胞から直接cardiomesodermの仕様を誘導するのに十分を発見）。我々は十分に制御された効率的な導出を可能にする、介在する多系統胚様体ステージのない多能性ヒトES細胞から直接cardioblastsの誘導のための条件を定義細胞ベースの治療のための発達段階のスペクトルにわたってヒト心筋細胞の大量供給。
Protocol
1。ソリューションとメディアの準備
- ゼラチンコーティング溶液：4で0.1％（w / v）ののddH 2 O、オートクレーブでゼラチンと店舗℃の
- マトリゲルコーティングソリューション。ストック溶液：° C一晩、10mlの氷冷DMEMまたはDMEM/F12を追加、よく混ぜて、アリコートを1ml /滅菌組織培養フードの下にチューブ、-20℃で保存します。4でゆっくりと解凍マトリゲル（10ml）をワーキングソリューション：遅い雪解け4で1ミリリットルマトリゲルのアリコート° C DMEMまたはDMEM/F12を冷やして14ミリリットルまで1-2時間、転送およびコーティングの直前に滅菌組織培養フードの下によく混ぜる。
- 人間のラミニンコーティング溶液：希釈1ミリリットルのヒトラミニン溶液を氷冷DMEMまたはDMEM/F12へと（トリスでは0.5 mg / mlの-80店舗、NaClをバッファ° C、1〜2時間、4℃でゆっくりと解凍） 12.5ミリリットルワーキング溶液（40μg/ ml）を滅菌組織培養フードの下にすぐにコーティングの前に。
- 成長因子のストック溶液（500 - 1000X）：10μgのに成長因子を溶かす滅菌緩衝液に/ mlの（0.5％BSA、1.0mMのDTT、10％グリセロール、1XPBS）と-80℃で50〜100μL/チューブアリコートなどの店舗℃まで
- hESCのメディア：DMEM/F12またはKO - DMEM（80％）、KO血清の交換（20％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MEM非必須アミノ酸（MNAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、フィルタリングして4℃で保存、使用前に20 ng / mlのbFGFを補充したC、。 DMEM/F12またはKO - DMEM（100％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MNAA（1X）、MEM必須アミノ酸（MEAA：または定義されたコンポーネントを使用して"KO血清代替物を"交換、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、濾過し、4で店のbFGF（20 ng / ml）を補充した° C、、ヒトインスリン（20μg/ ml）を、アスコルビン酸（50μg/ ml）を、人間使用前にアクチビンA（50 ng / ml）を、（10 mg / ml）をAlbumax /ヒトアルブミン、およびヒトトランスフェリン（8μg/ mlの）。
- ヒトES細胞心筋分化メディア：DMEM/F12（90％）、定義されたFBS（10％）、およびL -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を。
- メディアを含むニコチンアミド（NAM）：追加N準備の2週間以内にフィルタリングされた最終濃度10 mMにhESCのメディアまたはhESCの心臓分化の媒体、4℃で保存し、使用午前。
2。プレートコーティング
- ゼラチンでコートプレートは6ウェルプレートにゼラチン溶液を2.5ml /ウェルを追加し、37℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。
- コートのラミニンとプレート：チルゼラチンコートプレートとゼラチン削除は、2.5 mlを追加/予備冷却にもマトリゲルまたはヒトラミニンコーティングワーキングソリューションは、4℃で一晩6ウェルプレートとインキュベートしてゲル化。
3。定義された条件の下で未分化ヒトES細胞を継代し、シーディング
- ヒトES細胞のコロニー5-7日齢に成長できるように、と解剖顕微鏡（プリウォーム37に段階を解剖° C）滅菌フードを解剖下にヒトES細胞培養プレートを取る。
- ヒトES細胞のコロニーを分割する]を選択します。形態学的に、これらのコロニーは（SM> 75％未分化ヒトES細胞が必要です解剖顕微鏡下に定義されたエッジと、通常わずかに不透明すべてのコンパクトセル）、（ではない白積み重ねられた細胞ではなく、明確な分化細胞）。慎重に選択したコロニーを概説し、コロニーと、すべての差別化された部品をP2滅菌ピペットチップのエッジを持つコロニーの（もしあれば）またはガラスキャピラリーを引っ張っ周囲の差別化された線維芽細胞の層を取り除く。
- 吸引することで、浮動戸分化細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェル20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアを追加します。
- 小片に未分化ヒトES細胞のコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。
- 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。を1ml /一緒に20 ng / mlのbFGFおよびプールを含むだけでなくhESCのメディアで一回プレートを洗浄してください。
- コーティングされた新鮮なプレートからマトリゲルまたはヒトラミニン液を吸引除去する。分注し4ミリリットル/ウェルHESCメディアは、6ウェルプレートにコロニーの部分を含む。静かに振盪せずに培養器にプレートを転送し、5％CO 2の雰囲気で加湿37℃のインキュベーターを乱すことなく一晩コロニーピースシードを許可する。
4。ニコチンで定義された培養システムの下でヒトESの心臓の誘導
- 播種後3日目に、プレートの各ウェルから古いメディアのほとんどを削除し、ヒトES細胞のコロニーは、（ヒトES細胞が乾燥しても決して許さない）浸水することを許可するのに十分なメディアを残す。 20 ng / mlのbFGFおよび10mMのニコチンアミド（NAM）を含む4ミリリットル/よく新鮮なhESCのメディアと交換してください。
- 一日おきに20 ng / mlのbFGFおよび10mMのNAMを含む新鮮なhESCのメディアと古いメディアを交換し、そして心臓の誘発性hESCのコロニーが一日8-10に成長することができます。 NAMに公開する際に、コロニー内のすべてのセルは、乗算を続ける大規模な分化細胞に形態変化を受けることになる。コロニーは、大きさで、一日8-10増加するD細胞はコロニーのいくつかの分野で積み上げを開始します。
5。浮遊培養での継続的な心臓分化
- 滅菌フードを解剖下に解剖顕微鏡（37〜プリ暖かい解剖段階° C）へのヒトES細胞培養プレートを取る。慎重にコロニーを概説し、P2滅菌ピペットチップのエッジでコロニーを取り巻く線維芽細胞の層（分化した細胞がコロニー外に移行）を削除したり、ガラスが管を引っ張った。
- 吸引することで、浮動戸線維芽細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェルの新鮮なhESCのメディア（bFGFをせずに）を追加します。
- 小片に心臓誘導hESCのコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。
- 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。一緒に1ミリリットル/ウェルhESCのメディア（bFGFを除く）と、プールで一回プレートを洗浄してください。
- 分注し4メートル4〜5日間を形成する浮遊細胞のクラスターを（cardioblasts）できるように、37℃加湿インキュベーター中、6ウェル超低取付板とインキュベートしてコロニーの部分を含むL /ウェル無血清hESCのメディア。
6。接着培養における心筋細胞表現型の成熟を打っ
- 50 mlコニカルチューブに一緒にフローティングcardioblastsを含むメディアプール。 5分、1400 rpmで遠心する。あなたができる限り古い培地を吸引除去し、10mMのNAMを含む新鮮なhESCの心臓分化のメディアの同量を追加します。
- 4ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートにフローティングcardioblasts、アリコートを混在させる上下にピペッティングし。 cardioblastsが一晩アタッチできるように37℃の加湿インキュベーターにプレートを転送する。
- 一日おきに10 mMのNAMを含むhESCの心臓分化のメディアを交換してください。
- 8日目で、NAMなしhESCの心臓分化のメディアと交換して、ヒトES細胞心筋分化メディア電子を交換し続ける非常に他の日。拍動心筋細胞は、NAMの撤退後の連続培養の約1〜2週間で現れると、時間と数字で増加し始めるでしょう、そして3ヶ月以上のための強力でリズミカルな収縮を維持することができます。
7。代表的な結果：
ニコチンアミド（NAM）は、多能性を排他的にからcardiomesodermal表現型（ 図2B）に移行するために定義された培養系で維持ヒトES細胞を誘導するのに十分レンダリングされます。 NAMへの未分化ヒトES細胞の露光時に、コロニー内のすべての細胞はOCT - 4の発現をダウンレギュレートし、心臓特異的転写因子（CSX）Nkx2.5とα-を表現するために始めることが大きな分化細胞に形態変化を受けることになるcardiomesodermの表現型（ 図2B）と一致してアクチニン、。これらの分化した細胞は、乗算していきますし、コロニーのサイズが大きくなっています。 Nkx2.5の増加強度なります通常、細胞は（ 図2B）積み上げを開始コロニーの領域で観察される。取り外した後は、NAM -扱わヒトES細胞は、心臓分化のプロセスを続行するには懸濁培養でのフローティング細胞のクラスターを（cardioblasts）形成されます。の自発的な多系統分化と比較して添付するcardioblastsを許可し、1週間のためにNAMを治療するために継続した後、拍動心筋細胞は、効率の大幅な増加とNAMの撤退後の連続培養の約1-2週間で表示されるようになります同期間（ 図2C）以上治療せずにヒトES細胞。拍動心筋細胞のクラスター内のセルは、Nkx2.5とα-アクチニン（ 図2C）を含む、心筋細胞の特徴的なマーカーを発現するであろう。拍動心筋細胞の収縮は、pを連想させる定期的な衝動と、強力な、リズミカルな、よく調整された、とよく連行される電気のプロファイルにより確認された臨床心電図の体表面電極から見た- QRS - T -複合体（ 図2C、またビデオを参照）。心筋細胞は、3ヶ月以上のための彼らの強力な収縮性を保持することができます。
図1。専門の機能性細胞へのヒト多能性幹細胞の分化のための小分子誘導アプローチに対する従来のアプローチの全体的なスキーム。 （A）自発胚葉の分化を介してヒト多能性幹細胞の多系統傾きを用いて、従来のアプローチの概略を。排他的に小分子の単純な提供により、特定の臨床的に意義のある系統のヒト多能性幹細胞のよく制御された効率的な誘導の（B）の回路図。
図2。 ニコチンアミドは、定義された条件と心筋細胞の拍動に向かって進行の下で多能性の直接の心臓系統の仕様を誘導する。 （A）回路図は、ヒトES細胞の指示心臓分化のプロトコルのタイムラインを描いた。 （B）定義された培養システムの下でニコチンアミド（NAM）の未分化ヒトES細胞の曝露時には、コロニー内の大規模差別OCT - 4（赤）陰性細胞は、対照として、模擬処理（DMSO）ヒトES細胞に比べて、現れ始めた。 NAM -誘導OCT - 4陰性細胞は、早期の心臓分化と一貫性、速達Nkx2.5（緑）とα-アクチニン（赤）を始めた。 Nkx2.5の徐々に増加強度は通常の細胞を蓄積し始めた植民地の地域で観察された。すべての細胞はその核のDAPI染色（青色）で示されます。 （C）NAM誘発性心筋コミットヒトES細胞は、細胞のCLUSによって評価される、効率の大幅な増加に拍動心筋細胞が得られたリズミカルな収縮（電気生理学的特徴と動画を参照）、およびNkx2.5（緑）とα-アクチニン（赤）に対して免疫を表示TERS。代表的な大規模な暴行心筋細胞クラスターと心臓の筋肉を収縮代表的なのより高い電力の画像の位相画像は、（また、対応するビデオを参照）が表示されます。矢印は、電気生理学的記録のために使用される大規模な拍動心筋細胞のクラスターを示している。拍動心筋細胞の電気生理学的特徴は、臨床心電図に見られるP - QRS - T -複合体を連想させる定期的に、連行、リズミカルな衝動を示しています。スケールバーは0.1ミリメートル。
動画：NAM誘発ヒトESから分化した心筋細胞を締約。ビデオ1と2のショーの代表的な大規模な添付ファイルの後に約1から3ヶ月で心筋細胞のクラスターを破って。 ビデオ3以上のパワーで心臓の筋肉を収縮4は担当者。 ビデオ5ティピカを示しています。リットル小さな鼓動の心筋細胞のクラスターが自発的にコントロールとしてNAMの治療なしでヒトESから分化した。
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Discussion
発達研究と臨床の翻訳の両方の主要な課題の一つは、効率的かつ予測可能所望の表現型に多能性ヒト幹細胞の広範な分化能をチャネルする方法をされています。このような細胞は、自発的にヒトES細胞由来の多系統凝集体（胚様体）、細胞の唯一のごく一部（<2％）で、多系統の集約の段階を経由して、すべての胚葉の細胞に試験管内で自発的に区別することができますが、心筋細胞13から15（ 図1A）に分化する。以下の免疫選択、心筋細胞の濃縮された集団は、動物モデル13の中心に注入後、機械的および電子的に損傷した心筋の機能を救出するために生物学的ペースメーカーとして機能することができた。齧歯類梗塞モデルでは、移植されたヒトES細胞由来心筋子孫は生き残り、12週間まで成熟することができた、と部分的にremuscular傷ついた心をIZEと収縮機能14,15を改善する。しかし、移植後の多能性細胞と腫瘍形成のリスクが高いの多系統分化を通じて、人間の心臓、コミットされた細胞の生成の非効率性は、さらなる臨床の翻訳を妨げている。心臓の表現型への排他的かつ予測多能性ヒトES細胞の広い分化能を流すための戦略を開発することを活用心臓場でヒトES細胞の生物学の力に不可欠です。一様に特定の系統のヒト多能性幹細胞の変換を達成するために、我々は特定の臨床的に意義のある系統に独占的に多能性ヒトES細胞の十分に制御された効率的な誘導のための条件を識別するために、未分化ヒトES細胞の増殖を保証することのできる定義された培養系を採用小分子のシンプルなプロビジョニング（ 図1Bの ）で。我々は、ニコチンアミドは、pから直接心臓系統コミットメントを誘導することを発見さらなる高効率（ 図2）で拍動心筋細胞に進んで定義された文化の下でluripotentヒトES細胞。 Nkx2.5は、人間の先天性心疾患（CHD）、最も一般的な人間の先天性欠損症16に関連している遺伝子の正常な心臓の開発と変異のために不可欠な進化的に保存されたホメオボックス転写因子です。 Nkx2.5の発現は、これまで検討すべての脊椎動物における心臓前駆細胞の最も早いマーカーであり、適切な心臓の中隔および形成/電気伝導系16の成熟に必須である。脊椎動物では、初期のNkx2.5発現の発症とパターンはほぼ初期胚発生における心臓仕様のタイミングと面積と一致し、Nkx2.5遺伝子は、心臓16の開発によって表現され続けている。私たちのhESCのモデルでは、NAMは心臓特異transcriの発現を促進することにより、多能性ヒトES細胞から直接心臓の誘導を引き起こすように見えたヒト胚心臓発生における多能性胚盤葉上層からcardiomesodermの仕様をエミュレートする可能性があるプロセスでption因子Nkx2.5。今後の研究は再生治療のために臨床的に意義のある系統を派生させる場合にhESCの多能性の運命の小分子を介した直接制御と変調のための道を開く可能性がある、代替案として、人間の心の発達に遺伝的およびエピジェネティックな制御分子を明らかにする。 NAMの治療がなければ、<2％のヒトESは、心筋細胞12-15破っに自発的な分化を受けることになる。 NAMの治療では、我々は、ヒト胚心臓の開発12をエミュレートする可能性があるプロセスで定義する文化の下で保持ヒトES細胞から> 95％胚心臓の前駆体と> 50％の鼓動の心筋細胞を生成することができた。最近、知られている心臓の運命を決定する遺伝子は、<0.5％17、18の低効率と出生後の拍動心筋細胞にマウスの線維芽細胞の分化形質転換するために使用されている</>のSup。しかし、再プログラム体細胞は、歴史的に異常な遺伝子発現および障害の治療ユーティリティ19から21までの加速老化と関連している。最後に、我々はここで確立されたプロトコルは、内部細胞塊（ICM）または4,5人間の胚盤胞の胚盤葉上層に由来する多能性ヒトES細胞に限定される以前の桑実胚に由来する動物起源のESCは、ES細胞を含む他の多能性細胞、に適用されない場合があります（8細胞）ステージの胚22、および人工的に再プログラム細胞23。
Disclosures
著者らは、競合する利害を宣言する。 XHPはXceltheraの創設者です。 XHPとEYSは、ヒトES細胞に関連する知的財産を持っている。
Acknowledgments
XHPは、国立老化研究所（NIHK01AG024496）と母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（NIHR21HD056530）から健康（NIH）助成金の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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