Evaluering af Cancer Stem Cell Migration Brug afskaerme mikrofluidenheder og Live Cell Imaging

Summary

En afskaerme mikrofluid enhed til undersøgelse af kræft stamceller migration er beskrevet. Denne hidtil ukendte platform skaber en levedygtig cellulære mikromiljø og muliggør mikroskopisk visualisering af levende celler bevægelse. Stærkt motile kræftceller isoleres for at studere molekylære mekanismer for aggressiv infiltration og potentielt føre til mere effektive fremtidige behandlinger.

Abstract

I de seneste 40 år investeret i USA over 200 milliarder dollars på kræftforskning, hvilket resulterer i kun en 5% nedgang i dødelighed. En væsentlig hindring for at forbedre patienternes resultater er dårlig forståelse af mekanismer bag cellulær migration er forbundet med aggressiv cancer celle invasion, metastase og terapeutiske modstand ^1. Glioblastoma multiforme (GBM), den mest udbredte primære maligne voksne hjernetumor ² eksemplificerer dette problem. Trods standard kirurgi, stråling og kemoterapi, er tålmodig median overlevelse kun femten måneder, på grund af aggressiv GBM infiltration i tilstødende hjerne og hurtig cancertilbagefald ^2. Samspillet mellem afvigende celle vandrende mekanismer og tumormikromiljøet sandsynligvis skelne kræft fra normale celler ^3. Derfor forbedrer terapeutiske tilgange til GBM kræver en bedre forståelse af kræft cellemigration mekanismer. Nyere undersøgelser tyder på thata lille subpopulation af celler i GBM, kan hjernetumor stamcelle (BTSC), være ansvarlig for terapeutisk modstand og gentagelse. Mekanismer, der ligger BTSC vandrende kapacitet er først begyndt at blive karakteriseret ^1,4.

På grund af en begrænsning i visuel inspektion og geometriske manipulation, konventionelle migration assays ⁵ er begrænset til kvantificering samlede cellepopulationer. I modsætning hertil tillader mikrofluidenheder enkelt celle analyse på grund af kompatibilitet med moderne mikroskopi og kontrol over mikro-miljø ^6-9.

Vi præsenterer en metode til detaljeret karakterisering af BTSC migration ved hjælp af afskaerme mikrofluidenheder. Disse PDMS-udstyr efter kaste vævskultur miljø i tre forbundne rum: såning kammer, der modtager kammer og bygge bro microchannels. Vi skræddersyet enheden, således at begge kamre har tilstrækkelige medier til at understøtte levedygtige BTSC til 4-5 days uden medier udveksling. Meget mobile BTSCs oprindeligt indført i seeding kammeret er isoleret efter migrering dog bygge bro microchannels til den parallelle modtagende kammer. Denne migrering simulerer cancer cellulære spredning gennem mellemrummene i hjernen. Fase levende billeder af cellemorfologi under migration registreres over flere dage. Stærkt vandrende BTSC kan derfor være isoleret, recultured og analyseret yderligere.

Afskaerme mikrofluidik kan være en alsidig platform til at studere vandrende adfærd BTSCs og andre kræft stamceller. Ved at kombinere gradient generatorer, væskehåndtering, mikro-elektroder og andre mikrofluid moduler, kan disse enheder også anvendes til drug screening og sygdomsdiagnose ^6. Isolering af en aggressiv underpopulation af vandrende celler vil muliggøre studier af underliggende molekylære mekanismer.

Protocol

1. BTSC s celledissociering

BTSCs er afledt af allerede eksisterende kulturer dyrket i serumfrit stamcellemedium som neurosfærer. kultur som tidligere beskrevet ^{10, 11.}

1. Forbered cellesuspension fra BTSC-afledte neurosfærer. BTSC-afledte neurosfærer opsamles i et 15 ml konisk kolbe og centrifugeret ved 900 rpm i 5 minutter. Hurtigere centrifugering kan shear og / eller beskadigelse af neurosfærer. Supernatanten bortsuges og neurosfæren kultur resuspenderes i 0,5 ml forvarmet Accutase. Denne opløsning inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C gør det muligt for neurosfærer at løsne. Celler sønderdeles mekanisk med 10-20 bløde slag af en P100 pipette og derefter 1,5 ml stamcellemedium tilsættes til cellerne for at neutralisere Accutase.
2. De BTSCs centrifugeres derefter ved 1300 rpm i 5 minutter og resuspenderet i 1 ml stamcellemedium.
3. En 50 pi alikvot fjernes fra suspension og anbragt i et mikrocentrifugerør til celletælling. 50 pi af trypanblåt sættes til Eppendorf-rør, og suspensionen anbringes i et hæmocytometer til celletælling.
4. Hvis det er påkrævet efter celletælling, er yderligere stamcellemedium tilsat til BTSC suspensionen til opnåelse af en celledensitet på 20.000 levende celler / gl medier.

2. Fremstilling af bi-lag su-8 master og støbning af PDMS stempel (se figur 1)

Vi bruger optisk litografi og blød litografi til at fabrikere su-8 master og PDMS stempel, der er afgørende for samling af de mikrofluidenheder. Lidt anderledes end standard procedure ^12, er vores su-8 mester sammensat af to lag. De 3-um-høje microchannels er støbt i den første / nederste lag tidligere i processen, mens de 250-um-høje såning og modtage kamre er i det andet / øverste lag. For korrekt tilslutning mellem to kultur rum (mikrokanalplades og kamre), de to lag skal være præcist rettet ind på plads. Imidlertid tykkelse og opacitet af det andet lag er store nok til at blokere referenceenergi / optiske aligner i at få adgang bunden funktioner. Her har vi designe masker med Referencemærkernes markører bliver fjernt placeret. Således kan disse markører i det første lag selektivt beskyttet, mens spinding det andet lag. Som følge heraf er begge lag af funktioner fremstillet i et master og klar til støbning i relief af PDMS stempel.

1. Design og udarbejde to foto-masker. En maske består af to referencemærker markører og en matrix af mikrokanaler (400 um lang og 10-50 um bred) til det første lag. Anden maske består i podning og modtagende kamre (2 mm lange og 600 um bred) til det andet lag. Begge masker er designet i Illustrator (Adobe, Californien), laser-trykt på gennemsigtighed film (Tynde metaldele Colorado), renset med isopropanol og lufttørret.
2. Gør det første lag medsu-8 fotoresist (MicroChem, Massachusetts) i henhold til produkt manual fra leverandør. Første, spin-coating håndtaget wafer (WRS Materialer, California) med 3-um-tykke fotoresist af su-8 (5), efterfulgt af soft-bagning. Fotoresisten er derefter ultraviolet-eksponerede og helbredes med den tilsvarende maske i close-kontakt, efterfulgt af post-bagning og udvikle.
3. Spin-coat det andet lag med 250 um tykke su-8 (2100). For at undgå tykke fotoresist i at blokere referencemærkerne markører fra det første lag, dækker vi disse områder med tape i forud for spin-coating af det andet lag. Båndet derefter flåede ud til at afsløre de markører for tilpasning formål.
4. UV-eksponere det andet lag med den anden maske. Med tilpasningen markører afsløret, er det ligetil at tilpasse dem til dem i den anden maske ved hjælp af optisk maske aligner. Det andet lag af fotoresist er derefter ultraviolet-eksponerede og hærdet i tæt kontakt, efterfulgt af post-bagning og udvikling. </ Li>
5. Anti-stick belægning det resulterede master. For at hjælpe med fjernelse af hærdede PDMS, kan su-8 masteren være silaniseret via dampaflejring at gøre overfladen af ​​en nonstick-type coating. Blot placere det i en ekssikkator i mindst en time med adskillige dråber trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silanopløsning under vakuum.
6. Mold PDMS med master. Bland præpolymer base og curer af PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) i forholdet 10:1 grundigt. Placer den i en ekssikkator til vakuum afgasning, indtil der ikke luftboble ses. Hæld blandingen på masken og afgasses igen, hvis nye luftboble introduceres. Hærde støbeformen på en jævn varmeplade i 2 timer ved 90 ° C. Efter den er afkølet til stuetemperatur, forsigtigt af PDMS stempel. Således er dyrkning kanaler indgraveret i PDMS og klar til samling af enheden. Føreren er genbruges til støbning, indtil den er revnet eller slidt. Anti-klæbende belægning skal udføres igen, når klæbrigheden genvinder.

3.Montering af mikrofluidenheder og celledyrkning (figur 2)

For at dyrke celler, der træk-indgraveret PDMS stempel forbundet med et dækglas til dannelse af lukkede kanaler. Indgange og udgange er skabt for isætning af kultur / medier. I mellemtiden oprydning og andre procedurer til glassubstratet og PDMS stempel er nødvendige for at sikre celle-kompatibilitet.

1. Gøre reservoirer gennem PDMS stempel med biopsi hulleenheden. Vi vælger deres diameter til at være 6 mm. Disse reservoirer tjener to formål. Den ene er at holde ekstra næringsstof for cellevækst. Den anden er for adgang pipette lastning og vakuum aspiration.
2. Soak PDMS stempel i 70% ethanol i 30 minutter og derefter skylle det med de-ioniseret vand for en anden 10 min. Formålet er at rydde potentielle økologiske residualer indført under produktionsprocessen, og tværbundne PDMS forurening. Mere intense og grundig rengøring processer såsom organisk ekstraktion ¹³ 14 blev brugt andetsteds. Men vi fandt det unødvendigt i BTSC kultur.
3. Sterilisere PDMS stempel med autoklav (121 ° C, 35 min). Dette skridt videre fuldfører tværbinder omsætning af PDMS. Begyndende fra dette trin og indtil trin 3,6, er alle procedurer taget i steril måde.
4. PDMS stempel bliver derefter lagt på et dækglas, der tidligere var overtrukket med poly-L-lysin. ^15-17 Anordningen er derefter coatet med laminin ved at fylde kanalen med laminin opløsning natten over ved 37 ° C. Laminin aspireres fra indretningen, og indretningen vaskes med stamcellemedium.
5. Indlæse cellesuspension fra trin 1 i reservoirer og kanaler. 11 pi af dissocierede celler anbringes i en seeding reservoir. Vakuum aspiration anvendes til at tvinge cellerne til såning kammeret, hvis det er nødvendigt. Yderligere 7 pi af celler anbringes de tilstødende seeding reservoiret. Bemærk: Gennemsnitlig celledensitet er 20.000 celler / gl medier. Aftis fem minutter, såning og modtager reservoirer er oversvømmet med medierne.
6. Placer en 0,5-1 mm pre-autoklaveret PDMS ark på toppen. Den naturligt forekom overfladeadhæsion mellem to PDMS stykker vil cellekulturen forseglet og klar til transport, inkubation og mikroskopisk billeddannelse.

4. Langsigtet time-lapse billeder af BTSC migration med BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA).

Ved at kombinere kamera, software og inkubator alle i ét felt, gør denne mikroskopiske system, det muligt at billedet cellekultur med ingen forstyrrelse i flere dage. Desuden bevæger den unikke motorkonstruktion objektivlinsen og holder prøve fase stationært i punkt-visiting funktion. Dette gør det praktisk til billede parallelle eksperimenter og track celle bevægelseskomponenter i high-throughput analyse.

1. Præ-ækvilibrere Biostation IM i 45 minutter for at stabilisere temperaturen, fugt og lufttilførsel. Tilsætning af flere vand-contained retter i prøvekammeret anvendes til at opretholde en korrekt fugtighed.
2. Læg den celle-anordning i prøvekammeret af mikroskop, og centrer den ved hjælp af mikro pincet.
3. Indstille fokus, position-point og tid-point i Biostation software og start time-lapse.

5. Repræsentative resultater:

Eksempler på visuel inspektion og karakterisering af cancer cellemigration ved hjælp af en afskaerme mikrofluid anordning er illustreret i figur 3 og figur 4. Den cellelinje er BTSC. Med vores nuværende opsætning, kan fase-billeder af cellekultur kontinuerligt registreres, så længe 5 dage (fig. 3) og så hyppigt som hvert 2. sekund (figur 4). Beyond 5 dage, skal dyrkningsmedier at erstatte dem for næringsstof genopfyldning fjernet og affald. Vores langsigtede time-lapse identificerer en revolverende sekvens af seks celle etaper i løbet af sin vandring på grundlag af de morfologiske ændringer. Som illutreret i figur 3, vi beskriver dem som (i) præ-migration, (ii) indledning, (iii) sti-udforskning, (iv) cruising, (v) destination-exloration og (vi) post-migration. I den modtagende kammer, ophold spindel-formede celler i trin (i) som i bulk tumorer, som er i stand til at vokse, dele sig og gradvist overføre. Da de nærmer sig mikrokanalplade indgangen, nogle få celler videre til trin (ii), når de udvider og generere klæbende fremspring. Kun en af ​​dem er i stand til at indtage indgangen og fortsætte til trin (iii), som kan udforske migration retning. Når cellen bestemmer migration retning, fortsætter den til trin (iv) til cruise gennem mikrokanalen i en stabil og høj hastighed, som er ført gennem hele mikrokanal. Ved afslutningen af ​​mikrokanalplade, celle fortsætter til trin (v) at udforske det åbne rum for modtagekammer, og derefter til trin (vi). I mikrokanal, flytter strøm primært genereres ved blæredannelse aktiviteter, som vist i figur 4, svarer til amoeboid cell. Cell blæredannelse og membran deformation er fuldt registreret her.

Fig. 1. Skema for fremstillingen af mikrofluid enhed. Hele processen gennemføres på en 3-tommer siliciumhåndteringswaferen gennem en modificeret teknik blød litografi. 3-um-høje mikrokanaler og justeringsmærker, fremstilles som i det første lag. Derefter 250 um tykt su-8 er spin-coated, mens justeringsmærker, er dækket med tape, således at de senere kan være tilgængelige for maske aligner uden syn-blokering af tyk fotoresist. Således kan kammeret funktioner udføres som det andet lag og nøjagtigt tilpasset til det første lag. PDMS stempel til sidst støbt fra den resulterende master.

Figur 2. Skema for enhedens samling og cellepodning proces. Omgivet af PDMS og glrøv dækglas, er 3D dyrkning rum bestående af kamre, reservoirer og mikrokanaler. Seeding kammer er fyldt med cellekultur, medens modtagekammeret indledningsvis er fyldt med cellefrie medier. De microchannels der forbinder mellem dem giver celle migrerer trail fra såning side til modtagende side.

Figur 3. BTSC migration gennem mikrokanalplade. Øvre: snapshots af time-lapse vise en enkelt celle (fremhævet med grønt) vandrer over 400 um fra seeding side til den modtagende side. Hele turen tager omkring 2 dage, indebærer en sekvens af celle morfologiske ændringer. Skalaen bar er 40 um. Lavere: en tegneserie repræsentation af seks migration faser. Pre-migration (i): I såning kammer, spindel-formede og delelig celler gradvist vandrer langs hinanden. Cellerne nær mikrokanalplade indgangen løb med hinanden ved polariserende cellelegeme og e xerting lamellipodia fremspring. Indledning (ii): Den vandrende celle med den højeste kapacitet indtager kanal indgangen, mens konkurrenterne vil trække sig tilbage. Sti-efterforskning (iii): De vandrende celleforandringer til en amoeboid tilstand med lille polaritet. Denne migration tilstand er meget motile og i stand til at udforske vej i alle retninger ved blæredannelse lille membran fremspring. Cruising (iv): Når migrationen vej bestemmes, cellen forvandles til et tilpasset amoeboid tilstanden ved at opretholde en ekstra stor fremspring vej frem. Derved celle opretholder en høj motilitet samt en konstant retning og hastighed. Destination-efterforskning (v): Efter sti-ende cellen bremser og udvikler filopodias at udforske modtagekammeret for enhver invasion target. Post-migration (vi): Efter indtastning af modtagende kammer, celle bliver til stjerne-formet og bevarer høj motilitet, men ingen bestemt retning.

"/>
. Figur 4 snapshots af tidsforskudt viser cyklus af blæredannelse aktivitet og membran deformation af et BTSC: (AB). indledning, (BD). Ekspansion; (DF). Tilbagetrækning. Pilene og kurve-linier repræsenterer retningen og placeringen af ​​membranen deformation hhv. De snapshots indsamles hver 8 sekunder.

Discussion

Den mikrofluid enhed og image-optagelse teknik præsenteres her giver en visuel karakterisering af cellemorfologi under migration. Sammenlignet med de eksisterende konventionelle metoder, træk den mikrofluid platform fordele ved omkostningseffektivitet, høj kapacitet og design fleksibilitet. Den præsenterede mikroskopisk visualisering system tillader undersøgelse og registrering af langvarig levende cellemigrering. Linsen-motoriseret funktion gør det muligt at spore flere migrationsveje i en høj billed-opløsning uden at forstyrre prøven.

Under samling af indretningen, er PDMS stempel ikke-permanent bundet til dækglas til hjælp for PDL belægning (trin 3.4). Det er afgørende for at opnå en god tætning for succes i denne protokol. Kontaminering indført fra enheden fabrikation, såsom luftboble i stempel eller støv / affald på substratet, kan true binding og resulterer i det væsker. Derfor TREATIng enheden i et støvfrit måde er det vigtigt at undgå funktionssvigt. Forud for PDL-coating, de dækglas er salpetersyre behandles, og den PDL opløsning centrifugeres for at fjerne støv / affald. Vi finder Scotch tape, alkohol skyl, og vandbad meget nyttige i at fjerne støv / snavs fra PDMS stempel, hvis en ren værelse ikke er tilgængelig. Efter PDMS stempel gør kontakt med dækglas, letter trykke stemplet forsigtigt med en pincet tætningen.

BTSCs kan beriges fra humane operationsstuen prøver via kugle kultur i stamcellemedium, svarende til dyrkning af normale neurale stamceller ^10. BTSCs beriget på denne måde viser stamcelle-lignende egenskaber, såsom ekspression af stamceller markører (CD133, nestin), differentiering til flere neurale slægter (glia og neuronal), og tumorinitiering i en orthotopisk immundefekt musemodel med så få som 100 celler ^18. Selv om nogle debat eksisterer omkring renskation og vedligeholdelse af BTSCs ^{1, 19-21,} kugle-dyrkede BTSCs bedre opretholde fænotype og genotype af den parentale tumor ^22-24.

Den underinddelte space efterligner den fysiologiske miljø for cellemigrering. I vores enhed, udviser BTSC en stærk kapacitet til migration gennem en størrelsesselektiv tvungne rum ved at regulere cellulær morfologi. Vores karakterisering af cellens morfologiske ændringer indikerer mode-transformationer i en seks trins sekvens, som kan modellere en eventuel ny detaljeret beskrivelse af BTSC invasion af tilstødende hjerne. I tidlige stadier, får cellerne en betydelig mængde af polaritet og generere klæbende fremspring til effektivt at forankre sig selv inde i mikrokanalplade. Når cellen belægning i mikrokanalen er etableret, det konverterer til en cruising-tilstand og fastholder denne tilstand for hele rejsen gennem en mikrokanalplade. På dette stadium opretholder BTSC høj motilitet og ensartet retning, men bevare energi. Iterestingly fremgår det, at en mikrokanal er begrænset til én cruising celle ad gangen, således at når en enkelt celle fortsætter til denne fase, andre celler tilbagetrækning fra mikrokanalen. Denne mekanisme sandsynligvis sikrer effektiviteten af ​​tumor spredning og forhindrer overforbrug af næringsstoffer i mikrokanalplade. Efter at have udfyldt migration over den mikrokanalen, genvinder en celle sin tilbøjelighed til multidirectional fremspring og yderligere efterforskning for invasion mål eller nye migrationsveje. Den afskaerme mikrofluid enhed tilbyder en roman in vitro middel til at skabe et mikromiljø for at studere BTSC infiltration af hjerneparenkymet.

Denne metode kan let tilpasses til studiet af cancer stamcelle (CSC) og vandrende cellelinier afledt fra andre tumortyper. Dyrkning af celler i mikrofluid anordning kan udføres i enhver moderne biologi laboratorium, der er udstyret med en inkubator og vævskultur ekspertise. Udstyret med en su-8 master, PDMSstøbning og enhedens samling er mulige med nogle grundlæggende uddannelse i blød litografi. Desuden kan denne platform også udvides til andre applikationer med integration af andre funktionelle moduler såsom gradient mixer, overflade mønster, flydende kontrol og mikroelektrode.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose	GIBCO, by Life Technologies	11965	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Ham’s F12	GIBCO, by Life Technologies	31765	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
B27 supplement minus vitamin A	GIBCO, by Life Technologies	12587-010	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Antibiotic-Antimycotic (PSA)	GIBCO, by Life Technologies	15240	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant	GIBCO, by Life Technologies	PHG0313	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant	GIBCO, by Life Technologies	PHG0021	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H1027-250KU	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Laminin (natural mouse)	GIBCO, by Life Technologies	23017-015	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Accutase	EMD Millipore	SCR005	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Stem cell medium			30 % Hams F12 70% DMEM 1% antibiotic-antimycotic 2% B27 without vitamin A EGF (20 ng/mL) and bFGF/heparin (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparin) Mix ingredients and sterile filter before use
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin			Aliquot concentration 20 μg/ml For 25 μg: Add 1.25 mL of 5mg/mL Heparin to 25 μg bFGF. For 250 μg: Add 1 mL 5mg/mL Heparin to 250 μg bFGF. Transfer to 15 mL conical and add 11.5 mL 5 mg/mL Heparin to conical. Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Epidermal Growth Factor (EGF)			Aliquot concentration 20 μg/ml For 200 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 15 mL conical and add 9 mL DMEM. For 500 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 50 mL conical and add 24 mL DMEM. Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Heparin			Aliquot concentration 5 mg/ml Weigh out 100 mg heparin. Add 100 mg heparin to 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA) Sterile filter Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C
su-8 photoresist	MicroChem Corp.
Silicon handle wafer	WRS Materials	3P01-5SSP-INV
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS Sylgard 184	Dow Corning
laminin	BD Biosciences		50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration
Biostation IM	Nikon Instruments