Evaluering av Cancer Stem Cell Migration Bruke Compartmentalizing Microfluidic enheter og Live Cell Imaging

Summary

En compartmentalizing microfluidic enhet for etterforskning kreft stamceller migrasjon er beskrevet. Denne romanen plattform skapes en levedyktig mobilnettet mikromiljøet og gjør mikroskopisk visualisering av levende celle bevegelse. Svært bevegelige kreftceller er isolert for å studere molekylære mekanismer for aggressiv infiltrasjon, potensielt fører til mer effektive fremtidige terapier.

Abstract

I de siste 40 årene, investert USA over 200 milliarder dollar på kreftforskning, noe som resulterer i bare 5% reduksjon i dødelighet. Et stort hinder for å forbedre pasientens utfall er dårlig forståelse av mekanismene bak mobilnettet migrasjon assosiert med aggressiv kreft celle invasjon, metastasering og terapeutisk motstand ^1. Glioblastoma multiforme (GBM), den mest utbredte primære ondartet voksen hjernesvulst ^to, eksemplifiserer dette problemet. Til tross for standard kirurgi, stråling og kjemoterapi, er pasienten median overlevelse bare femten måneder, på grunn av aggressiv GBM infiltrasjon i tilstøtende hjernen og rask kreft tilbakefall ^to. Interaksjonene mellom avvikende celle trekkende mekanismer og svulsten mikromiljøet sannsynlig skille kreft fra normale celler ^tre. Derfor, bedre terapeutiske tilnærminger for GBM krever en bedre forståelse av kreft celle migrasjon mekanismer. Nyere arbeid antyder thata små subpopulasjon av celler i GBM kan hjernesvulst stamcelle (BTSC), være ansvarlig for terapeutisk motstand og tilbakefall. Mekanismene bak BTSC vandrende kapasitet er bare begynner å bli preget ^1,4.

På grunn av en begrensning i visuell inspeksjon og geometriske manipulasjon, konvensjonelle migrasjon analyser ⁵ er begrenset til tallfesting samlede cellepopulasjoner. I kontrast, microfluidic enheter tillate enkelt celle analyse på grunn av kompatibilitet med moderne mikroskopi og kontroll over mikro-miljøet ^6-9.

Vi presenterer en metode for detaljert karakterisering av BTSC migrasjon hjelp compartmentalizing microfluidic enheter. Disse PDMS-laget enheter kastet vevet kultur miljø i tre tilkoblede avdelinger: seeding kammer, kammer og bygge bro microchannels. Vi skreddersydd enheten slik at begge kamre har nok media til å støtte levedyktige BTSC for 4-5 days uten media utveksling. Svært mobile BTSCs utgangspunktet introdusert i seeding kammeret er isolert etter overføringen skjønt bygge bro microchannels til parallell kammer. Dette migrasjon simulerer kreft cellular spredning gjennom mellomrommene i hjernen. Fase levende bilder av cellemorfologi under trekket er registrert over flere dager. Langtmigrerende BTSC kan derfor være isolert, recultured, og analyseres videre.

Compartmentalizing MicroFluidics kan være en allsidig plattform for å studere trekkadferden av BTSCs og andre kreft stamceller. Ved å kombinere gradient generatorer, fluidbehandlende, mikro-elektroder og andre microfluidic moduler, kan disse enhetene også brukes for narkotika screening og sykdom diagnose ^6. Isolering av en aggressiv undergruppe av trekkende cellene vil muliggjøre studier av underliggende molekylære mekanismer.

Protocol

1. BTSC celle dissosiasjon

BTSCs er avledet fra pre-eksisterende kulturer dyrket i serumfritt stamcelle medium som neurospheres. kultur som er tidligere beskrevet ^{10, 11.}

1. Forbered cellesuspensjon fra BTSC-deriverte neurospheres. BTSC-avledede neurospheres samlet i et 15 ml konisk rør og sentrifugeres ved 900 opm i 5 minutter. Raskere sentrifugering kan klippe og / eller skade neurospheres. Supernatanten aspirert og neurosphere kultur resuspenderes i 0,5 ml av forvarmede Accutase. Denne løsningen inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C slik at neurospheres å løsne. Celler blir mekanisk avbrutt med 10-20 milde slag av en P100 pipette og deretter 1,5 ml av stamcelle medium tilsatt til cellene for å nøytralisere Accutase.
2. De BTSCs blir deretter sentrifugert ved 1300 opm i 5 minutter, og resuspendert i 1 ml av stamcelle medium.
3. En 50 pl alikvot er fjernet fra suspension og plassert i en mikrosentrifuge tube for Celletellingen. 50 ul av Trypan blå tilsettes til Eppendorf-rør og suspensjonen plasseres i en hemocytometer for Celletellingen.
4. Hvis nødvendig etter Celletellingen, ekstra stamcelle medium tilsatt til BTSC suspensjonen for å gi en celletetthet på 20.000 levende celler / ul media.

2. Fabrikasjon av bi-lag su-8-master og støping av PDMS stempel (se figur 1)

Vi bruker optisk litografi og myk litografi å dikte su-8 master og PDMS stempel, som er avgjørende for montering av microfluidic enheter. Litt annerledes enn den standard prosedyre ¹² er vårt su-8 mester består av to lag. Den 3-mikrometer-høye mikrokanaler er støpt i den første / bunnsjiktet tidligere i prosessen, mens de 250-um-høye seeding og mottak kamre står i andre / øvre lag. For korrekt tilkobling mellom to kultur avdelinger (microchannels og kamre), de to lagene må være nøyaktig på linje i posisjon. Imidlertid, tykkelse og opasitet av det andre laget er store nok til å blokkere fiducial / optisk aligner tilgangen bunnen funksjonene. Her vi designe maskene med fiducial markører blir eksternt plassert. Således kan disse markørene i det første laget være selektivt skjermet mens spinning det andre laget. Som et resultat, er begge lag av funksjonene gjort i en herre og klar for støping i bas-relieff av PDMS stempel.

1. Design og forberede to foto-masker. En maske består av to fiducial markører og en matrise av mikrokanaler (400 um lang og 10-50 mikrometer bred) for det første laget. Annen maske består av såing og motta kamre (2 mm lang og 600 mikrometer brede) for det andre laget. Begge maskene er laget i Illustrator (Adobe, California), laser-trykt på transparenter (Thin metalldeler, Colorado), renset med isopropanol og lufttørket.
2. Gjør det første laget medsu-8 fotoresist (MICROCHEM, Massachusetts) i henhold til produkthåndboken fra leverandør. Først, spinn-coat håndtaket wafer (WRS Materialer, California) med 3-mikrometer tykk fotoresist av su-8 (5), etterfulgt av soft-baking. Fotoresisten er deretter ultrafiolett eksponert og kureres med tilsvarende maske i nær-kontakt, etterfulgt av post-baking og utvikling.
3. Spin-coat det andre laget med 250 mikrometer tykke su-8 (2100). For å hindre at tykke fotoresist fra blokkerer fiducial markører fra det første laget, dekker vi disse områdene med scotch tape i før spin-belegning av det andre laget. Tapen blir deretter skrelles av å avdekke markører for justering formål.
4. UV-utsett andre lag med andre maske. Med justeringsmerkene avslørt, er det enkelt å justere dem til de i andre masken ved hjelp av optisk maske aligner. Det andre laget av fotoresist er deretter ultrafiolett-eksponert og herdet i tett-kontakt, etterfulgt av post-baking og utvikling. </ Li>
5. Anti-stick frakk resulterte master. Å hjelpe til ved fjerning av herdet PDMS kan su-8 masteren bli silaniserte via dampavsetning å gjøre overflaten en nonstick-attraksjon belegg. Ganske enkelt sette det inn i en desikator for minst en time, med flere dråper triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorinert) silanløsning under vakuum.
6. Mold PDMS med mesteren. Bland prepolymer base og curer av PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) i forholdet 10:1 grundig. Plasser den i en eksikkator for vakuum avgassing til ingen luftbobler blir sett. Hell blandingen på masken og Degas igjen hvis ny luftboble er innført. Kurere mold på et nivå varmeplaten i 2 timer ved 90 C. Etter det avkjøles til romtemperatur, forsiktig slipper PDMS stempel. Således er dyrking kanaler inngravert i PDMS og klar for montering av enheten. Kapteinen er gjenbrukbare for støping før den er sprukket eller slitt. Den antiklebende belegg må utføres på nytt når stickiness gjenvinner.

3.Montering av microfluidic enheter og celledyrking (figur 2)

For å dyrke celler, er funksjon-gravert PDMS stempel festet til et dekkglass for å danne lukkede kanaler. Innløp og utløp er skapt for lasting av kultur / media. Mellomtiden opprydding og andre prosedyrer for å glasset underlaget og PDMS stempel er nødvendig for å sikre den celle-kompatibilitet.

1. Gjør reservoarer gjennom PDMS stempel med biopsi hullemaskin. Vi velger sin diameter til å være 6 mm. Disse reservoarene tjener for to formål. Det ene er å holde ekstra næringsstoff for cellevekst. Den andre er for adgang pipetten lasting og vakuumaspirasjon.
2. Bløtlegg PDMS stempel i 70% etanol i 30 min, og deretter skylle den med de-ionisert vann i en annen 10 min. Hensikten er å fjerne potensielle organiske rester introdusert under fabrikasjon prosessen, og uncrosslinked PDMS forurensning. Mer intense og grundig rengjøring prosesser som organisk utvinning ¹³ 14 ble brukt andre steder. Men vi fant det unødvendig BTSC kultur.
3. Steriliser PDMS stempel med autoklav (121 ° C, 35 min). Dette trinnet fullfører ytterligere crosslink reaksjon PDMS. Starter fra dette trinnet og før trinn 3.6, er alle prosedyrer tatt i steril måte.
4. Den PDMS stempel blir deretter lagt på et dekkglass, som er tidligere belagt med poly-L-lysin. ^15-17 Enheten blir deretter belagt med laminin ved å fylle kanalen med laminin løsning natten over ved 37 ° C. Laminin suges fra enheten og enheten blir vasket med stamceller medium.
5. Laste cellesuspensjon fra trinn 1 i reservoarer og kanaler. 11 pl av dissosierte celler er plassert i en seeding reservoaret. Vakuumaspirasjon brukes til å tvinge celler inn seeding kammeret, om nødvendig. Ytterligere 7 ul av celler er plassert tilstøtende seeding reservoaret. Merk: Gjennomsnittlig celletetthet er 20.000 celler / ul medier. Aktereh fem minutter, seeding og motta reservoarer er oversvømmet med media.
6. Plasser en 0,5 til 1 mm pre-autoklaverte PDMS ark på toppen. Den naturlig oppstått overflate vedheft mellom to PDMS brikkene vil gjøre cellekultur forseglet og klar for transport, inkubering og mikroskopisk avbildning.

4. Langsiktig time-lapse avbildning av BTSC migrasjon med BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA).

Kombinere kamera, programvare og inkubator i én eske, gjør dette mikroskopiske system det mulig å image cellekultur med ingen uroligheter i flere dager. I tillegg beveger sin unike motor design objektiv og holder prøve scenen i ro i punkt-besøk funksjonen. Dette gjør det praktisk å image parallelle eksperimenter og spor celle locomotion i high-throughput analysen.

1. Pre-stabilisere den BioStation IM i 45 minutter til å stabilisere temperaturen, fuktighet og lufttilførselen. Tilsetting av flere vann-contained retter i prøvekammeret brukes til å opprettholde riktig luftfuktighet.
2. Laste celle-inneholdt enhet i prøvekammeret av mikroskop, og sentrer det bruker mikro pinsett.
3. Sette fokus, posisjon-poeng og tid-poeng i BioStation programvare og start time-lapse.

5. Representative resultater:

Eksempler på visuell inspeksjon og karakterisering av kreftcelle migrasjon ved å bruke en compartmentalizing microfluidic enhet er illustrert i Figur 3 og Figur 4. Celle-linjen er BTSC. Med vår nåværende oppsettet kan fase bilder av cellekultur bli kontinuerlig registrert så lenge som 5 dager (figur 3) og så hyppig som hver 2 sekunder (figur 4). Utover 5 dager, dyrkingsmedier må byttes for næringsstoff påfyll og avfall fjernes. Vår langsiktige time-lapse identifiserer en roterende sekvens av seks celle stadier i løpet av sin migrasjon basert på de morfologiske endringer. Som visttrert i figur 3, vil vi beskrive dem som (i) pre-migrasjon, (ii) initiering, (iii) bane-leting, (iv) cruising, (v)-destinasjon exloration og (vi) etter migrasjon. I den mottakende kammeret, spindel-formede celler bo i trinn (i) som i bulk svulster som er i stand til å vokse, dele og gradvis migrere. Som de nærmer seg microchannel inngangen, noen få celler fortsette å iscenesette (ii) når de utvider og generere lim protrusion. Bare en av dem er i stand til å oppta inngangen og fortsett til trinn (iii), noe som kan utforske migrasjon retning. Når cellen bestemmer migrasjon retning, fortsetter den å stadiet (iv) å cruise gjennom microchannel i en jevn og høy hastighet, noe som er gjennomført gjennom hele microchannel. På slutten av microchannel, celle utbyttet til trinn (v) for å utforske den åpne plass mottakskammer, og deretter til trinn (vi). I microchannel, er migrering strøm hovedsakelig generert av blebbing aktivitet som illustrert i figur 4, lik som amoeboid cell.. Cell blebbing og membran deformasjon er fullt registrert her.

Figur 1. Schematics av fabrikasjon av microfluidic enhet. Hele prosessen er gjennomført på en 3-tommers silisium håndtak wafer gjennom en modifisert teknikk av myk litografi. 3-mikrometer-høye mikrokanaler og innretting markører gjøres som i det første laget. Deretter 250-um-tykk su-8 er spin-belagt, mens justeringsmerkene er dekket med Scotch tape, slik at de senere kan være tilgjengelige for å maskere aligner uten syn-blokkering av tykk fotoresist. Dermed kan kammer funksjoner gjøres som det andre lag, og nøyaktig på linje med det første laget. PDMS stempel er slutt støpt av den resulterende master.

Figur 2. Schematics på enheten montering og celle seeding prosess. Omsluttet av PDMS og glass dekkglass, er 3D dyrking plass består av kamre, reservoarer og microchannels. Seeding kammeret er fylt med cellekultur, mens mottakskammeret er opprinnelig fylt med celle-frie medier. De microchannels som kobler mellom dem gi celle migrering stien fra seeding side å motta side.

Figur 3. BTSC migrasjon gjennom microchannel. Øvre: øyeblikksbilder av time-lapse viser en enkelt celle (uthevet i grønt) vandrer over 400 mikrometer fra seeding side til mottakersiden. Hele turen tar ca 2 dager, med en sekvens av celle morfologiske endringer. Målestokk er 40 mikrometer. Nedre: en tegneserie representasjon av seks migrasjon etapper. Pre-migrering (I): I seeding kammer, spindel-formet og dividable celler gradvis overføre langs hverandre. Cellene nærheten microchannel inngangen rase med hverandre ved polariserende cellelegemét og e xerting lamellipodia protrusion. Initiering (ii): vandrende celle med den høyeste kapasiteten opptar kanalen inngangen mens konkurrentene vil trekke. Sti-leting (iii): De trekkende celleforandringer til en amoeboid modus med lite polaritet. Dette migrasjon modusen er ekstremt bevegelig og i stand til å utforske banen i alle retninger ved blebbing små membran fremspring. Cruising (iv): Når migreringen bestemmes, forvandler cellen til et tilpasset amoeboid modus ved å opprettholde et ekstra stort fremspring overskriften fremover. Denne måten, opprettholder celle en høy motilitet samt en jevn retning og hastighet. Destinasjon-leting (v): Ved bane-end, bremser cellen ned og utvikler filopodias å utforske mottakskammeret for noen invasjon målet. Post-migrasjon (vi): Etter at den mottakende kammeret, blir cellen til stjerne-formet og beholder høy motilitet men ingen bestemt retning.

"/>
. Figur 4 Snapshots av time-lapse viser syklusen av blebbing aktivitet og membran deformasjon av en BTSC: (AB). initiering, (BD). Ekspansjon, (DF). Dementi. Pilene og kurve-linjene representerer retning og plassering av membran deformasjon, henholdsvis. Øyeblikksbilder samles hver 8 sekunder.

Discussion

Microfluidic enheten og bilde-opptak teknikk presenteres her gjør en visuell karakterisering av mobilnettet morfologi under trekket. Sammenlignet med eksisterende konvensjonelle metoder, har microfluidic plattformen fordeler av kostnadseffektivitet, høy gjennomstrømming og design fleksibilitet. Den presenterte mikroskopiske visualisering system tillater studier og opptak av langsiktige live celle migrasjon. Linsen-motorisert funksjonen gjør det mulig å spore flere migrasjonsveier i en høy bilde-oppløsning uten å forstyrre prøven.

Under montering av enheten, er PDMS stempel ikke-permanent limt til glasset dekkglass for bekvemmeligheten av PDL belegg (trinn 3.4). Det er avgjørende for å oppnå en god forsegling for å lykkes med denne protokollen. Forurensning innført fra enheten fabrikasjon, slik som luft boble i stempel eller støv / rusk på substratet, kan det utsette liming og resultere i væske lekker. Derfor treating enheten i et støvfritt måte er viktig for å forebygge feil med enheten. Før PDL-belegg, glass dekkglass er salpetersyre behandles og PDL oppløsningen sentrifugert for å fjerne støv / rusk. Vi finner Scotch tape, alkohol skyll og vannbad svært nyttig i å fjerne støv / rusk fra PDMS stempel, hvis et rent rom er ikke tilgjengelig. Etter PDMS stempel å ta kontakt med dekkglass, trykke stempelet forsiktig med pinsett forenkler forseglingen.

BTSCs kan bli beriket fra menneskelige operasjonssykepleiere prøver via sfære kultur i stamcelleforskningen medium, lik kultur normale nevrale stamceller ^10. BTSCs beriket på denne måten demonstrere stamcelle-lignende egenskaper, for eksempel uttrykk for stamcelleforskningen markører (CD133, nestin), differensiering til flere nevrale linjene (glial og neuronal), og startfasen i en orthotopic immunsupprimert mus modell med så få som 100 celler ^18. Selv om noen debatt finnes om renseteknologining og vedlikehold av ^{en BTSCs, 19-21,} sfære vokst BTSCs bedre opprettholde fenotype og genotype av foreldrepermisjonen svulst ^22-24.

Den compartmentalized plass etterligner den fysiologiske miljø for celle migrasjon. I enheten vår, BTSC viser en sterk evne til migrasjon gjennom en størrelse begrenset plass ved å regulere cellulære morfologi. Vår karakterisering av cellen morfologiske endringer indikerer modus-transformasjoner i en seks trinns sekvens som kan modellere en mulig ny detaljert beskrivelse av BTSC invasjon av tilstøtende hjernen. I tidlige stadier, cellene får en betydelig mengde av polaritet og generere lim fremspring å effektivt forankre seg inne i microchannel. Når cellen belegg i microchannel er etablert, konverterer den til en cruising modus og opprettholder denne modusen for hele reisen gjennom et microchannel. På dette stadiet, BTSC opprettholde høy motilitet og konsekvent retning, men spare energi. Iterestingly, ser det ut til at en microchannel er begrenset til én cruising celle om gangen, slik at når en enkelt celle fortsetter til dette stadiet, andre celler retrett fra microchannel. Denne mekanismen sikrer trolig effektiviteten av tumor spredning og hindrer overforbruk av næringsstoffer i microchannel. Etter endt migrasjon over microchannel, gjenvinner en celle sin tilbøyelighet for allsidig fremspring og videre leting etter invasjonen mål eller nye migrasjonsveier. Den compartmentalizing microfluidic enheten tilbyr en roman in vitro betyr å skape en mikromiljøet for å studere BTSC infiltrasjon av hjernen parenchyma.

Denne metoden kan lett tilpasses til studiet av kreft stamcelle (CSC) og trekkende cellelinjer avledet fra andre tumortyper. Dyrkning celler i microfluidic enheten kan utføres i en hvilken som helst moderne biologi laboratorium som er utstyrt med en inkubator og vevskultur kompetanse. Utstyrt med en su-8 master, PDMScasting og enheten montering er mulig med noen grunnleggende opplæring i myk litografi. I tillegg kan denne plattformen også utvides for andre applikasjoner med integrere andre funksjonelle moduler som gradient mikser, overflate mønster, væskekontroll og mikroelektroden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose	GIBCO, by Life Technologies	11965	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Ham’s F12	GIBCO, by Life Technologies	31765	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
B27 supplement minus vitamin A	GIBCO, by Life Technologies	12587-010	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Antibiotic-Antimycotic (PSA)	GIBCO, by Life Technologies	15240	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant	GIBCO, by Life Technologies	PHG0313	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant	GIBCO, by Life Technologies	PHG0021	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H1027-250KU	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Laminin (natural mouse)	GIBCO, by Life Technologies	23017-015	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Accutase	EMD Millipore	SCR005	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Stem cell medium			30 % Hams F12 70% DMEM 1% antibiotic-antimycotic 2% B27 without vitamin A EGF (20 ng/mL) and bFGF/heparin (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparin) Mix ingredients and sterile filter before use
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin			Aliquot concentration 20 μg/ml For 25 μg: Add 1.25 mL of 5mg/mL Heparin to 25 μg bFGF. For 250 μg: Add 1 mL 5mg/mL Heparin to 250 μg bFGF. Transfer to 15 mL conical and add 11.5 mL 5 mg/mL Heparin to conical. Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Epidermal Growth Factor (EGF)			Aliquot concentration 20 μg/ml For 200 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 15 mL conical and add 9 mL DMEM. For 500 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 50 mL conical and add 24 mL DMEM. Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Heparin			Aliquot concentration 5 mg/ml Weigh out 100 mg heparin. Add 100 mg heparin to 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA) Sterile filter Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C
su-8 photoresist	MicroChem Corp.
Silicon handle wafer	WRS Materials	3P01-5SSP-INV
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS Sylgard 184	Dow Corning
laminin	BD Biosciences		50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration
Biostation IM	Nikon Instruments