Summary
GENPLAT(GLBRC酶纲要“)是一个生物质降解酶鸡尾酒的发现和优化的自动化平台。它可适应多种原料和包含多个组件的酶的混合物。
Abstract
酶的生物质解构的成本高,木质纤维原料的液体运输燃料如乙醇的经济转换的一个主要障碍。我们已经开发了一个集成的高通量平台,为来自不同的预处理/生物组合的糖释放的发现和开发新的酶和酶鸡尾酒GENPLAT。 GENPLAT包括四个要素:个人纯酶,统计设计的实验,生物泥浆和酶的机器人pipeting,并自动发布GLC和木糖colorimeteric决心。个人酶在毕赤酵母或里氏木霉 ,中的表达,或从商业鸡尾酒或新型微生物提取物的色谱净化生产。单纯格(部分因子)混合模型设计商业设计实验统计软件的使用。高度复杂的酶混合物性构造成96格式的机器人pipeting。发布GLC和木糖的测量是采用酶联比色法自动化。已经过测试,对各种原料和预处理组合优化酶的混合物,含有多达16个组件。
GENPLAT是适应纯酶,商业产品的混合物(例如,1000 Accellerase和Novozyme 188),新型微生物的提取物,或组合的混合物。为了使测试〜10纯酶的混合物,要求小于100微克每一个蛋白质和少于100人的总反应,蛋白质15毫克/ G葡聚糖在最后的总负荷运行时。我们使用从多个来源的酶。纯化的酶可以从天然来源,如真菌文化(如黑曲霉(Aspergillus niger),Cochliobolus carbonum,Galerina marginata),或他们可以通过编码基因的表达(从增加numbe获得R的微生物基因组序列)在诸如E.主机大肠杆菌,毕赤酵母 ,或如T.丝状真菌瑞氏木霉 。蛋白质也可以从商业酶鸡尾酒(例如,Multifect木聚糖酶,Novozyme 188)的纯化。越来越多的纯酶,包括糖基水解酶,细胞壁积极酯酶,蛋白酶,和裂合酶,可从商业来源,例如,Megazyme公司(www.megazyme.com),NZYTech(www.nzytech.com) PROZOMIX(www.prozomix.com)。
设计专家软件(STAT - EASE,公司)是用于创建单纯晶格的设计和分析响应(在这种情况下,GLC和木糖发布)。混合物含有4-20组件,它可以在0和100%之间的比例不同。检测点通常包括足够数量的干预点,以产生一个有效的模型的极端顶点。在实验设计的术语,我们的研究大多是“混合”的实验,这意味着一笔将组件添加到一个全社会固定资产蛋白加载(毫克/克葡聚糖表示)。单纯晶格的混合物的数量依赖于混合物中的元件数目和多项式(二次或三次)的程度。例如,6组件的实验将需要63增强特殊的立方模型不同的反应,它可以检测三个双向互动,而只有23个人的反应是必要的增强二次模型。对于包含超过八个组成部分的混合物,二次实验设计更实用,而且在我们的经验,这种模型通常是统计学上有效的。
所有的酶负荷,最后总负荷(我们的实验通常是15毫克蛋白质/ G葡聚糖)的百分比表示。对于“核心”的酶,较低的百分比限制设置为5%。此限制是来自我们的经验,GLC和/或木糖的产量非常低,如果任何核心酶是目前在0%。不良模型结果从太多的样品表现出非常低的GLC或木糖产量。依次设置下限,确定一个上限。也就是说,一个六分量的实验,如果设置为5%的下限为每个单独的组件,然后将各单项组件的上限75%。被视为“附件”的所有其他酶的下限设置为0%。 “核心”和“附件”的名称有点乱,将基板上的不同而有所不同,但在我们的研究从玉米秸秆释放GLC的核心酶包括以下酶从T 瑞氏木霉 :CBH1(也被称为Cel7A),CBH2(Cel6A),EG1(Cel7B),BG(β-葡萄糖苷酶),EX3(远藤-β1,4 -木聚糖酶,GH10),和BX(β-木糖苷酶)。
Protocol
1。产酶
- 在毕赤酵母中的蛋白质生产到向量pPICZ或pPICZα相应基因的克隆和改造成体育酵母 。在百思不得其解的500毫升烧瓶增长甲醇诱导细胞在300毫升的批次,每24小时(班纳吉等人,2010A)。
- 精矿和切向流过滤脱盐培养滤液。
- 商店小等分的酶在20%甘油于-80 ° C。毫克/毫升的浓度范围是1-10。
2。试验设计
- 输入要测试的酶的数量,他们的上限和比例较低(例如一个核心酶的5%的比例较低)和实验设计的类型(例如,二次或三次)到设计,Expertsoftware。
- 计算微克每一个要加入使总负载的15毫克/克葡聚糖酶的数量,然后计算出每一种酶在μL的量添加到每个反应。
- 生成Excel工作表指定配药水和酶的实验设计和使用从文件转移功能导入Biomek的FXP软件源的实验器皿,井源,目的地实验室器皿,目的地水井,和传输卷。
3。酶解
- 暂停50 mM柠檬酸钠,pH值4.8生物质的泥浆,含5μg/ ml的四环素和5微克/毫升酮,在桨水库。
- 机器人吸管的泥浆200μL到每孔96孔深孔反应板采用跨度8 1000 -μL与去年0.5厘米切断的吸管提示。一次混合的泥浆,在100μL/秒,然后吸桨水库相同体积和分配到板。
- 免除到同一板使用的程序输入到贝克曼FX的酶。
- 穿孔capmats密封板。
- 倒像,挖掘板块多次克服表面张力。杂交孵化器旋转10转48小时,放置在50 ° C的板块。
4。 GLC和木糖的测定
- 摆动桶离心机在1250 XG 3分钟离心反应板。
- 100μL上清转移到常规96孔板使用的Biomek FX AP96 POD。
- 孵育板在90-95 ° C下10分钟,以灭活酶,然后在1250 XG离心30秒。
- GLC测量,转移到常规的96孔板12μL上清。加入192μL的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOPOD)试剂。板在50 ° C孵育20分钟,并宣读酶标仪在510 nm处的吸光度。空白是没有酶反应混合物。
- 木糖测量,转移到384孔板4μL。加入检测试剂,并在340 nm处读取的板块。空没有酶的反应混合物。
5。数据分析
- 转换的吸光度值%GLC和木糖产量的基础上著名的GLC和木糖的原生物质的含量。这些百分比作为回应导入到设计专家软件。检查统计paramenters,以确保一个强大的模型的标准履行。
- 确认实验的最佳模型预测。
6。与GENPLAT代表性的成果:
(1)建立个人纯蛋白质的优化混合物 。结果表明酶是重要的,以及在什么比例,而其中的酶并不重要。一些蛋白质丰富的T.瑞氏木霉 secretome(Nagendran等,2009),如Cip1和Cip2,玉米秸秆预处理氨纤维膨胀(AFEX)或碱性路政署没有作用发挥GLC释放 rogen过氧化氢法(AHP)(班纳吉等人,2010B)。另一方面,一些蛋白质是出乎意料的重要。例如,内切木聚糖酶糖基水解酶家族10日和11日都是重要的GLC释放一个木聚糖酶不能为其他(班纳吉等人,2010B,C)代替。 Cel61A,轻微的蛋白质中的T.瑞氏木霉 secretome,是非常重要的GLC,但不木糖释放。某些酶的重要GLC和木糖的释放,而另一些仅适用于一个或另一个(班纳吉等人,2010C)的必要。
16个组件,每一个合成的混合物,含有浓度为0.94毫克/毫升(即非优化的混合物),发布从AFEX预处理的DDG - 38%可用GLC。在相同的条件下水解下,优化的混合物,其中的16个组件的浓度范围从0%到32%,52%的GLC公布(图2)。这个实验说明了建设定义混合物的效用。
_content“>(2)建立不同的预处理/基材组合优化的鸡尾酒。当前商业纤维素酶制剂是”一个尺寸适合所有“,在现实中,最好的鸡尾酒取决于基板和预处理。单一产品如Accellerase 1000提供了从不同的基板,以同样的方式预处理,从接触到不同的预处理(图1)在同一基板不同的收益率。我们用GENPLAT优化多个预处理和多发原料(班纳吉等纯酶的混合物人,2010C)。图2显示了如何AFEX预处理玉米秸秆,AHP预处理玉米秸秆,AFEX预处理DDG - 16纯酶最佳酶的比例不同。只有11酶在图2所示,因为最佳被发现的其他5个(Cel61B AbfB,Cip1,Cip2,并Cel12A)的比例为0%(班纳吉等人,2010C)。(3)新型酶的发现 提取物比t 瑞氏木霉和A 。 尼日尔不同衬底上生长。加入到我们的核心设置一个特别提取带动GLC产量。负责蛋白质纯化,并没有任何商业酶制剂(Banerjee和沃尔顿,未公布结果)是一种新的糖基水解酶。
(4)发现更好的酶 。显示GENPLAT哪些酶是最重要的的一个退化特别是生物质,我们有更好的理解其中的酶应重点改善。可以找到更好的关键酶的例子在自然界寻找或蛋白质工程。 (一种酶可以“更好”比T.瑞氏木霉同源取决于所需的属性,在几个方面,例如,更高的具体活动,更大的协同作用,减少蛋白水解的灵敏度,或热稳定性增强)。 GENPLAT,提供了一个有意义的化验可能更好的酶平台,因为它采用了切实复杂的鸡尾酒(重要,因为没有生物酶隔离工程)和一个现实的基板(重要的,因为纯纤维素或其他人造基板的结果可能不相关天然木质纤维材料)。
(5)商业酶的优化 。纯酶的数量足够大的还没有在现实世界中存在。直到他们这样做,乙醇亲ducers必须依靠商业产品,如Accellerase 1000和MultifectXylanase。然而,商业酶的混合物,通常执行比任何个人的更好,GENPLAT可用于设计多个商业酶的优化鸡尾酒。图3显示了GENPLAT使用优化的四种商业酶制剂的混合物。 AFEX预处理DDG - GLC释放的最佳比例分别为47%Accellerase1000 Multifect果胶酶Novozyme 188,22%和4%Multifect木聚糖酶(班纳吉等人,2010C),27%。图3b显示AFEX - DDG - GLC产量从四个酶制剂的差异;优化的商用混合物提供了更高的GLC产量仅比Accellerase1000,SpezymeCP单独,或16组件的合成混合物。这个实验还表明,16组件的合成混合物是缺少一个或多个酶最佳GLC释放,这是在一个或更多的商业酶需要。 GENPLAT可以被我们教育署,以确定这样的组件。
图1。没有一个单一的商业酶制剂是所有基材和所有预处理的最佳选择。五基板和三个预处理磨(0.5毫米粒度)的类似条件下进行比较,酶量(15毫克/克葡聚糖)和水解条件(48小时,50 ° C)A.不同的AFEX预处理基板消化Accellerase 1000。B.消化玉米秸秆预处理Accellerase 1000由三个不同的方法(见班纳吉等人,2010C)。
图 11 AFEX预处理玉米秸秆(AFEX - CS),碱性过氧化氢 预处理玉米秸秆法(AHP - CS),或AFEX预处理干GLC释放酶的最佳比例提取2 。ERS“五谷(AFEX副总干事)。班纳吉等人的数据。 (2010C)。沿的酒吧上方的数字是在生物样品的总GLC%GLC产量。
图3。GENPLAT使用产生四个AFEX预处理DDG - GLC发布的商业酶制剂的优化混合物。 Multifect木聚糖酶的贡献最小(4%),因此,从这个三元相图省略。B.从AFEX DDG - GLC产量与在相同的条件下水解(15毫克/克葡聚糖酶,48小时,50℃)不同的酶处理。 “四组分商业”已确定的比例从如图所示的实验。 3A。
Discussion
人们普遍认识到,降低酶的成本经济的木质纤维素乙醇产业的发展是很重要的。目前可用的商业酶鸡尾酒复杂不清的许多蛋白质(Nagendran等人,2009年)的混合物,他们主要是为适应酸预处理的玉米秸秆使用。为了加快发展更好的酶鸡尾酒,一些实验室已经开发出高通量平台,酶的发现和鉴定。在这方面的努力已纳入也发现在GENPLAT以下属性的一个或多个:配药机器人的酶和生物量的泥浆,统计,实验设计,和/或GLC自动化的决心和木糖(柏林等,2007;德克尔等。人,2009年;金等,1998; King等,2009)。 GENPLAT扩展这些早期的努力,最显著最多6个组件,可以从分析的复杂性,在酶的混合物早期的研究在我们的最新作品,以超过16(班纳吉等人,2010C)。 GENPLAT其它关键特性是珠混合室(桨水库)的使用,可以保持在配药暂停秸秆泥浆;温柔消化在年底高端旋转混合;和自动化比色法测定谷氨酸和木糖。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国能源部能源大湖生物能源研究中心“(能源部办公室科学的BER DE - FC02 - 07ER64494),并授予DE - FG02 - 91ER200021中的一部分,美国能源部基础能源科学,科办公室化学科学,地球科学和生物科学。我们感谢他们的物质和概念贡献的John Scott Craig和梅丽莎Borrusch。
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