GENPLAT: En automatiseret platform for biomasse Enzyme Discovery og Cocktail optimering

Summary

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) er et automatiseret platform for opdagelse og optimering af enzym cocktails til biomasse nedbrydning. Det kan tilpasses til flere råmaterialer og blandinger af enzymer, som indeholder flere komponenter.

Protocol

1. Enzymproduktion

1. Producerer proteiner i Pichia pastoris ved kloning af de tilsvarende gener i vektorer pPICZ eller pPICZα og omdannelse til P. pastoris. Grow celler i 300-ml partier i forbløffet 500-ml kolber med methanol induktion hver 24 time (Banerjee et al., 2010a).
2. Koncentrat og desalt kulturen Filtratet ved tangential flow filtrering.
3. Opbevar enzymer i små mængder i 20% glycerol ved -80 ° C. Det koncentrationsområde er 1-10 mg / ml.

2. Design af eksperiment

1. Input antallet af enzymer, der skal testes, deres øvre og lavere andel (fx en lavere andel på 5% for core enzymer), og typen af ​​eksperimentelle design (fx kvadratisk eller kubisk) i Design-Expertsoftware.
2. Beregn mængden i mg hver enkelt enzym, der skal tilføjes at lave en samlet belastning på 15 mg / g glucan, og derefter beregne størrelsen af ​​den enkelte enzym i mikroliter med føje tilhver reaktion.
3. Generer Excel-regneark med angivelse af kilde labware, kilde brønde, destination labware, destination brønde, og overføre mængder til dispensering af vand og enzymer i henhold til det eksperimentelle design og importere det til Biomek FXP software ved hjælp af transfer-fra-fil-funktionen.

3. Enzymatisk hydrolyse

1. Hæng biomasse gyllen i 50 mM natriumcitrat, pH 4,8, indeholdende 5 mg / ml tetracyklin og 5 mg / ml cycloheximid i pagajen reservoiret.
2. Robotersvejsede pipette 200 μl af gyllen i hvert hul paa en 96-brønds dyb-godt modholdsplader hjælp Span-8 1000-μl pipettespidser med de sidste 0,5 cm skåret af. Bland gyllen én gang på 100 μl / sek og derefter aspirér samme volumen fra pagajen reservoiret og dispensere ind i pladerne.
3. Dispenser de enzymer i den samme plade ved hjælp af programmet indgik den af ​​Beckman FX.
4. Forsegl plader med punktérbar capmats.
5. Inverter, og trykpladerne flere gange for at overvinde overfladespænding. Placér pladerne ved 50 ° C i 48 HR i hybridisering inkubatoren roterende ved 10 rpm.

4. Bestemmelse af GLC og Xyl

1. Centrifugér reaktionen plader i 3 min på 1250 xg i en svingende spand centrifuge.
2. Overfør 100 μl af supernatanten til regulær 96-brønds plader med AP96 pod af Biomek FX.
3. Pladerne inkuberes ved 90-95 ° C i 10 min for at inaktivere de enzymer, og derefter centrifugeres ved 1250 xg i 30 sek.
4. For Glc målinger, overførsel 12 μl af supernatanter til regulær 96-brønds plader. Tilsæt 192 μl af glukose oxidase / peroxidase (GOPOD) reagens. Pladerne inkuberes ved 50 ° C i 20 min og læse absorbansværdi ved 510 nm i en mikrotiterplade læser. Blank er reaktionsblandingen uden enzym.
5. For Xyl målinger, overførsel 4 μl i 384-godt plader. Tilsæt analysereagenserne og læse pladerne ved 340 nm. Blanker reaktionsblandingen uden enzym.

5. Dataanalyse

1. Konverter absorbansen værdier til deres% Glc og Xyl renter baseret på den kendte Glc og Xyl indholdet af den oprindelige biomasse. Import disse procentsatser, som svarene i Design-Expert software. Kontroller statistiske paramenters at være sikker på, at kriterierne for en robust model er opfyldt.
2. Bekræft den bedste model forudsigelse eksperimentelt.

6. Repræsentative resultater med GENPLAT:

(1) Oprettelse af optimerede blandinger af individuelle rene proteiner. Resultaterne viser, hvilke enzymer er vigtige, og i hvilke proportioner, og også som enzymer er ikke vigtigt. Nogle proteiner, der er rigelige i T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), som f.eks Cip1 og Cip2, synes at spille nogen rolle i Glc løsladelse fra majshalm forbehandlet af ammoniak fiber ekspansion (AFEX) eller basisk Hyd Rogen peroxid (AHP) (Banerjee et al., 2010b). På den anden side er nogle proteiner uventet vigtig. For eksempel er endo-xylanases af glycosylphosphatidylinositolspecifikt hydrolase familier 10 og 11 begge er vigtige for Glc løslades; en xylanase kan ikke erstatte den anden (Banerjee et al, 2010b, c.). Cel61A, en mindre protein i T. reesei secretome, er meget vigtigt for Glc men ikke Xyl udgivelse. Nogle enzymer er vigtige for frigivelse af både Glc og Xyl, mens andre kun er nødvendigt til den ene eller den anden (Banerjee et al., 2010C).

En syntetisk blanding, der indeholder 16 komponenter, hver i en koncentration på 0,94 mg / ml (dvs. en ikke-optimeret blanding), frigivet 38% af de tilgængelige Glc fra AFEX-forbehandlet DDG. Under identiske hydrolyse betingelser, en optimeret blanding, hvori koncentrationerne af de 16 komponenter varierede fra 0% til 32%, frigives 52% af Glc (fig. 2). Dette eksperiment illustrerer nytten af ​​konstruere definerede blandinger.

_content "> (2) Oprettelse af optimeret cocktails til forskellige forbehandling / substrat kombinationer. Gængs cellulase præparater er" one-size-fits-all ". I virkeligheden, afhænger den bedste cocktail på både underlag og forbehandling. et enkelt produkt såsom Accellerase 1000 giver forskellige udbytter fra forskellige substrater forbehandlet på samme måde, og fra samme substrat udsat for forskellige forbehandlinger (fig. 1). Vi har brugt GENPLAT til at optimere blandinger af rene enzymer til flere forbehandlinger og multipel energiafgrøder (Banerjee et al., 2010C). Figur 2 viser, hvordan den optimale enzym proportioner af 16 rene enzymer er forskellig for AFEX-forbehandlet majshalm, AHP-forbehandlet majshalm, og AFEX-forbehandlet DDG. Kun 11 enzymer er vist i Fig. 2, fordi den optimale proportioner af de øvrige fem (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, og Cel12A) blev anset for at være 0% (Banerjee et al., 2010C).

(3) Nye enzym opdagelsen T. reesei og A. niger dyrket på forskellige substrater. En særlig ekstrakt forstærket Glc udbyttet, når tilføjet til vores kerne sæt. Den ansvarlige protein blev renset og vist sig at være en roman glycosylphosphatidylinositolspecifikt hydrolase ikke til stede i nogen form for kommerciel enzympræparat (Banerjee og Walton, upublicerede resultater).

(4) Discovery af bedre enzymer. Have vist med GENPLAT hvilke enzymer er vigtigst for nedbrydning af enisær biomasse, vi har en bedre forståelse af, hvilke enzymer bør være i fokus for forbedringer. Bedre eksempler på den kritiske enzymer kunne findes ved at søge i naturen eller fremstillet af protein engineering. (Et enzym, kunne være "bedre" end sine T. reesei homolog på flere måder, afhængigt af den ønskede ejendom, f.eks højere specifik aktivitet, større synergi, nedsat proteolytisk følsomhed, eller forbedrede termiske stabilitet). GENPLAT giver en meningsfuld platform for analysering potentielt bedre enzymer, fordi det udnytter en realistisk kompleks cocktail (vigtigt, fordi ingen biomasse enzym virker i isolation) og en realistisk substrat (vigtige, fordi resultaterne med ren cellulose eller andre kunstige substrater ikke kan være relevante for naturlige træcellulose materialer).

(5) Commercial enzym optimering. Tilstrækkeligt store mængder af ren enzymer endnu ikke eksisterer i den virkelige verden. Indtil de gør det, ethanol Producenter må stole på kommercielle produkter som Accellerase 1000 og MultifectXylanase. Men blandinger af kommercielle enzymer generelt klarer sig bedre end nogen enkelt en, og GENPLAT kan bruges til at designe optimerede cocktails af flere kommercielle enzymer. Figur 3 viser brugen af ​​GENPLAT til at optimere en blanding af fire kommercielle enzympræparater. Den optimale forhold for frigivelse af GLC fra AFEX-forbehandlet DDG blev fundet at være 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozymes 188, og 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al., 2010C). Figur 3B viser forskellene i Glc udbyttet fra AFEX-DDG med fire enzympræparater, den optimerede kommercielle blandingen giver højere Glc udbytte end Accellerase1000 alene, SpezymeCP alene, eller en 16-komponent syntetisk blanding. Dette eksperiment viser også, at den 16-komponent syntetisk blanding mangler et eller flere enzymer er nødvendige for optimal Glc udgivelse, som er til stede i en eller flere af de kommercielle enzymer. GENPLAT kan være osed at identificere sådanne komponenter.

Figur 1. Ingen enkelt kommerciel enzympræparat er optimal for alle underlag og alle forbehandlinger. Fem substrater og tre forbehandlinger blev sammenlignet under samme betingelser for slibning (0,5 mm partikelstørrelse), enzym læsning (15 mg / g glucan), og hydrolyse betingelser (48 h, 50 ° C). A. fordøjelse af forskellige AFEX-forbehandlet underlag med Accellerase 1000. B. fordøjelsen af majshalm forbehandlet med tre forskellige metoder med Accellerase 1000 (se Banerjee et al., 2010C).

Figur 2. Optimal proportioner af 11 enzymer til frigivelse af GLC fra AFEX-forbehandlet majshalm (AFEX-CS), alkalisk hydrogenperoxid-forbehandlet majshalm (AHP-CS), eller AFEX-forbehandlet tørret destilleregernes korn (AFEX-DDG). Data er fra Banerjee et al. (2010C). Tal langs toppen af ​​søjlerne er det Glc udbytte, som en procent af den samlede Glc i biomassen prøven.

Figur 3. A. Brugen af GENPLAT til at producere en optimeret blanding af fire kommercielle enzympræparater for frigivelse af GLC fra AFEX-forbehandlet DDG. Multifect Xylanase gjort det mindste bidrag (4%) og blev derfor udeladt af denne ternær diagram. B. Glc udbyttet fra AFEX-DDG med forskellige enzym behandlinger under identiske hydrolyse betingelser (15 mg / g glucan enzym, 48 h, 50 ° C) . "Fire-komponent kommercielle" er proportionerne bestemt ud fra forsøget er vist i Fig. 3A.

Discussion

Det er almindeligt anerkendt, at reducere omkostningerne af enzymer er vigtig for udviklingen af ​​en økonomisk træcellulose ethanol industrien. I øjeblikket tilgængelige kommercielle enzym cocktails er komplekse og dårligt definerede blandinger af mange proteiner (Nagendran et al., 2009), og de er tilpasset primært til brug på syre-forbehandlet majsstængler. For at fremskynde udviklingen af ​​bedre enzym cocktails, har flere laboratorier udviklet high-throughput platforme for enzym opdagelse og karakterisering. Indsatsen på dette område har indarbejdet en eller flere af følgende egenskaber også findes i GENPLAT: robot udlevering af enzymer og biomasse slam, statistisk design af eksperiment, og / eller automatisk bestemmelse af GLC og Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. kong et al, 2009).. GENPLAT udvider disse tidligere indsats, mest markant i kompleksiteten af ​​enzymet blandinger, der kan analyseres ud fra højst 6 komponenter ide tidligere undersøgelser til mere end 16 i vores seneste arbejde (Banerjee et al., 2010C). Yderligere centrale elementer i GENPLAT er brugen af ​​en perle blandingskammer (paddle reservoir), der kan holde Stover slam suspenderet under dispensering, blid blanding under fordøjelsen ved udgangen-over-end rotation, og automatiserede kolorimetrisk bestemmelse af Glu og Xyl.