GENPLAT: en Automated Plattform for Biomasse enzym Discovery og Cocktail Optimization

Summary

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) er et automatisert plattform for oppdagelse og optimalisering av enzym cocktails for biomasse degradering. Det kan tilpasses til flere feedstocks og blandinger av enzymer som inneholder flere komponenter.

Abstract

Den høye kostnaden av enzymer for biomasse dekonstruksjon er en stor hindring for den økonomiske konvertering av lignocelluloseholdige feedstocks til flytende transport drivstoff som etanol. Vi har utviklet en integrert høy gjennomstrømning plattform, kalt GENPLAT, for oppdagelsen og utviklingen av nye enzymer og enzym cocktails for frigjøring av sukker fra ulike forbehandling / biomasse kombinasjoner. GENPLAT består av fire elementer: individuelle rene enzymer, statistiske design av eksperimenter, robot pipeting av biomasse slam og enzymer, og automatisert colorimeteric fastsettelse av frigitte GLC og Xyl. Individuelle enzymer er produsert av uttrykk i Pichia pastoris eller Trichoderma reesei, eller ved kromatografisk rensing fra kommersielle cocktails eller utdrag av romanen mikroorganismer. Simplex gitteret (delvis faktoriell) blanding modeller er designet ved hjelp av kommersielle Design av Experiment statistisk programvare. Enzyme blandinger av høy komplekseligheten er konstruert ved hjelp av robot pipeting inn i en 96-brønnen format. Målingen av frigitte GLC og Xyl er automatisert bruker enzyme-linked kolorimetriske analyser. Optimalisert enzym blandinger som inneholder så mange som 16 komponenter har blitt testet på et utvalg av råstoff og forbehandling kombinasjoner.

GENPLAT kan tilpasses til blandinger av rene enzymer, blandinger av kommersielle produkter (f.eks Accellerase 1000 og Novozyme 188), ekstrakter av romanen mikrober, eller kombinasjoner av disse. Å lage og teste blandinger av ~ 10 rene enzymer krever mindre enn 100 mikrogram av hvert protein og færre enn 100 total reaksjoner, brukes ved en endelig samlet lasting av 15 mg protein / g glukan. Vi bruker enzymer fra flere kilder. Enzymer kan bli renset fra naturlige kilder, for eksempel sopp-kulturene (for eksempel Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum og Galerina marginata), eller de kan gjøres ved uttrykk for koding gener (hentet fra den økende number av mikrobiell genom sekvenser) i hosts som E. coli, Pichia pastoris, eller en filamentous sopp som T. reesei. Proteiner kan også bli renset fra kommersielle enzym cocktails (f.eks Multifect xylanase, 188 Novozyme). Et økende antall rene enzymer, inkludert glykosyl hydrolases, cellevegg-aktiv esteraser, proteaser, og lyases, er tilgjengelig fra kommersielle kilder, f.eks Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) , og PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert programvare (Stat-Ease, Inc.) brukes til å lage simplex-gitter design og å analysere svarene (i dette tilfellet, GLC og Xyl utgivelse). Blandinger inneholder 4-20 komponenter, som kan variere i proporsjon mellom 0 og 100%. Assay poeng typisk omfatte ekstreme hjørnene med et tilstrekkelig antall gripe poeng for å generere en gyldig modell. I terminologien av eksperimentell design, de fleste av våre studier er "blanding" eksperimenter, noe som betyr at summen av enll komponenter legger til en samlet fast protein lasting (uttrykt som mg / g glukan). Antallet blandinger i simplex-gitteret avhenger både antall komponenter i blandingen og graden av polynomet (kvadratisk eller kubisk). For eksempel vil en 6-komponent eksperimentere innebære 63 separate reaksjoner med en utvidet spesielle kubisk modell, som kan oppdage treveis interaksjoner, mens bare 23 individuelle reaksjoner er nødvendig med en utvidet kvadratiske modell. For blandinger som inneholder mer enn åtte komponenter, er en kvadratisk eksperimentell design mer praktisk, og vår erfaring er slike modeller er vanligvis statistisk gyldige.

Alle enzym belastninger er uttrykt som en prosentandel av den endelige samlede lasting (som for våre eksperimenter er vanligvis 15 mg protein / g glukan). For "core" enzymer, er lavere prosentandel grensen satt til 5%. Denne grensen ble utledet fra vår erfaring i som gir av GLC og / eller Xyl var svært lav hvis noen kjerne enzym var til stede på 0%. Dårlig modeller resultat av altfor mange prøver viser svært lav GLC eller Xyl avkastning. Sette en nedre grense i sin tur bestemmer en øvre grense. Det er, for en seks-komponent eksperiment, hvis den nedre grensen for hver enkelt komponent er satt til 5%, deretter den øvre grensen for hver enkelt komponent skal være 75%. Den nedre grensen for alle andre enzymer betraktes som "tilbehør" er satt til 0%. "Core" og "tilbehøret" er noe vilkårlige betegnelser og vil variere avhengig av underlaget, men i våre studier kjernen enzymer for utgivelsen av GLC fra mais Stover består av følgende enzymer fra T. reesei: CBH1 (også kjent som Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glukosidase), EX3 (endo-β1 ,4-xylanase, GH10) og BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Enzyme Produksjon

1. Produsere proteiner i Pichia pastoris ved kloning av tilsvarende gener i vektorer pPICZ eller pPICZα og transformasjon til P. pastoris. Grow celler i 300 ml partier i baffled 500-ml flasker med metanol induksjon hver 24. time (Banerjee et al., 2010a).
2. Konsentrer og avsalte kulturen filtratet ved tangential flow filtrering.
3. Oppbevar enzymer i små alikvoter i 20% glycerol ved -80 ° C. Konsentrasjonen serien er 1-10 mg / ml.

2. Design av Experiment

1. Input antall enzymer som skal testes, deres øvre og nedre proporsjoner (f.eks en lavere andel på 5% for kjerne enzymer), og den typen eksperimentelle design (f.eks, kvadratisk eller kubisk) inn i Design-Expertsoftware.
2. Beregn beløpet i mikrogram av hvert enzym som skal legges til totalt lasting av 15 mg / g glukan, og deretter beregne mengden av hver enzym i mL å legge tilhver reaksjon.
3. Generer Excel regneark angi kilde Labware, kilde brønner, destinasjon Labware, destinasjon brønner, og overføre volumer for dispensering av vann og enzymer i henhold til eksperimentell design og importere det inn i Biomek FXP programvaren ved hjelp av transfer-fra-fil funksjon.

3. Enzymatisk hydrolyse

1. Suspend biomassen slurry i 50 mM natriumsitrat, 4,8 pH, inneholder 5 mikrogram / ml tetracyklin og 5 mikrogram / ml cycloheximide i padle reservoaret.
2. Robotically pipettér 200 mL av slurry i hver brønn av en 96-brønnen er dyp-brønn reaksjon plater med Span-8 1000-mL pipette tips med de siste 0,5 cm avskåret. Bland slurry gang på 100 mL / sek, og deretter aspirer samme volum fra padle reservoaret og dispensere inn i platene.
3. Tilsett enzymer i samme plate bruke programmet inngått Beckman FX.
4. Seal platene med pierceable capmats.
5. Invert og trykkplatene flere ganger for å overvinne overflatespenning. Plasser platene ved 50 ° C i 48 timer i hybridisering inkubator roterende på 10 rpm.

Fire. Fastsettelse av GLC og Xyl

1. Sentrifuger reaksjonen plater for 3 min ved 1250 xg i en svingende bøtte sentrifuge.
2. Overfør 100 mL av supernatanten i regulær 96-brønn plater med AP96 pod av Biomek FX.
3. Inkuber platene ved 90-95 ° C i 10 min for å inaktivere enzymer, og deretter sentrifuger ved 1250 xg i 30 sek.
4. For GLC målinger, overføre 12 mL av supernatants i regulær 96-brønn plater. Legg til 192 mL av glukose oksidase / peroksidase (GOPOD) reagens. Inkuber skålene ved 50 ° C i 20 min og lese absorbances ved 510 nm i en mikroplateleser. Blank er reaksjonsblandingen uten enzym.
5. For Xyl målinger, overføre 4 mL til 384-brønnen plater. Legg analysen reagenser og lese platene ved 340 nm. Blanker reaksjonsblandingen uten enzym.

5. Data Analysis

1. Konverter absorbansen verdier til sine% GLC og Xyl avkastning basert på den kjente GLC og Xyl innholdet i den opprinnelige biomasse. Import disse prosentsatsene som svarene inn i Design-Expert programvare. Sjekk statistisk paramenters å være sikker på at kriteriene for en robust modell er oppfylt.
2. Bekreft den beste modellen prediksjon eksperimentelt.

Seks. Representative resultater med GENPLAT:

(1) Opprettelse av optimalisert blandinger av enkelte rene proteiner. Resultatene indikerer hvilke enzymer er viktige, og i hvilke proporsjoner, og også hvilke enzymer er ikke viktig. Noen proteiner som er rikelig i T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), som Cip1 og Cip2, synes å spille noen rolle i GLC løslatelse fra mais Stover forbehandlet med ammoniakk fiber ekspansjon (AFEX) eller alkaliske hyd Rogen peroxide (AHP) (Banerjee et al. 2010b). På den annen side, noen proteiner er uventet viktig. For eksempel, endo-xylanases av glykosyl hydrolase familier 10 og 11 er begge viktige for GLC utgivelse, en xylanase kan ikke erstatte den andre (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, en mindre protein i T. reesei secretome, er svært viktig for GLC men ikke Xyl release. Noen enzymer er viktige for utgivelse av både GLC og Xyl, mens andre er nødvendig bare for det ene eller det andre (Banerjee et al. 2010C).

En syntetisk blanding inneholder 16 komponenter, hver på en konsentrasjon på 0,94 mg / ml (dvs. et ikke-optimalisert blanding), utgitt 38% av de tilgjengelige GLC fra AFEX-forbehandlet DDG. Under identiske hydrolyse forhold, en optimalisert blanding, der konsentrasjonene av de 16 komponentene varierte fra 0% til 32%, ga 52% av GLC (Fig. 2). Dette eksperimentet illustrerer nytten av å bygge definerte blandinger.

_content "> (2) Opprettelse av optimalisert cocktails for ulik forbehandling / substrat-kombinasjoner. Nåværende kommersielle cellulase preparater er" one-size-fits-all ". I virkeligheten avhenger det beste cocktail på både underlaget og forbehandling. En enkelt produkt som Accellerase 1000 gir ulik avkastning fra ulike underlag forbehandlet på samme måte og fra samme underlaget utsatt for ulike forbehandlinger (Fig. 1). Vi har brukt GENPLAT å optimalisere blandinger av rene enzymer for flere forbehandlinger og mutiple feedstocks (Banerjee et al. 2010C). Figur 2 viser hvordan den optimale enzymet proporsjoner av 16 rene enzymer forskjellig for AFEX-forbehandlet mais Stover, AHP-forbehandlet mais Stover, og AFEX-forbehandlet DDG. Kun 11 enzymer er vist i fig. 2 fordi den optimale Andelene av de andre fem (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, og Cel12A) ble funnet å være 0% (Banerjee et al. 2010C).

(3) Novel enzym Oppdagelsen T. reesei og A. niger dyrket på ulike underlag. En spesiell ekstrakt økte GLC yield da lagt til vår kjernekompetanse sett. Ansvarlig protein ble renset og vist seg å være en roman glykosyl hydrolase ikke tilstede i noen kommersielle enzym forberedelse (Banerjee og Walton, upubliserte resultater).

(4) Discovery av bedre enzymer. Etter å ha vist med GENPLAT hvilke enzymer som er viktigst for nedbrytning av etSpesielt biomasse, har vi en bedre forståelse av hvilke enzymer bør være fokus for forbedring. Bedre eksempler på kritiske enzymer kan bli funnet ved å søke i naturen eller gjort av protein engineering. (Et enzym kan være "bedre" enn sine T. reesei homolog på flere måter, avhengig av ønsket eiendom, redusert f.eks høyere spesifikk aktivitet, større synergi, proteolytisk følsomhet, eller forbedret termisk stabilitet). GENPLAT gir en meningsfylt plattform for å analysere potensielt bedre enzymer, fordi den utnytter en realistisk kompleks cocktail (viktig fordi ingen biomasse enzymet fungerer i isolasjon) og en realistisk substrat (viktig fordi resultatene med ren cellulose eller andre kunstige underlag som ikke kan være relevant til naturlige lignocelluloseholdige materialer).

(5) Kommersiell enzym optimalisering. Tilstrekkelig store mengder ren enzymer ennå ikke eksisterer i den virkelige verden. Inntil de gjør, etanol producers må stole på kommersielle produkter som Accellerase 1000 og MultifectXylanase. Men blandinger av kommersielle enzymer generelt bedre resultater enn noen individuell én, og GENPLAT kan brukes til å designe optimalisert cocktails av flere kommersielle enzymer. Figur 3 viser bruken av GENPLAT å optimalisere en blanding av fire kommersielle enzym preparater. Den optimale proporsjoner for utgivelsen av GLC fra AFEX-forbehandlet DDG ble funnet å være 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, og 4% Multifect xylanase (Banerjee et al. 2010C). Figur 3B viser forskjellene i GLC yield fra AFEX-DDG med fire enzym forberedelser, den optimaliserte kommersiell blanding gir høyere GLC yield enn Accellerase1000 alene, SpezymeCP alene, eller en 16-komponent syntetisk blanding. Dette eksperimentet viser også at 16-komponent syntetisk blanding mangler ett eller flere enzymer som trengs for optimal GLC utgivelsen, som er til stede i en eller flere av de kommersielle enzymer. GENPLAT kan være ossed å identifisere slike komponenter.

Figur 1. Ingen enkelt kommersielt enzym forberedelse er optimal for alle underlag og alle forbehandling. Fem underlag og tre forbehandlinger ble sammenlignet under like betingelser for sliping (0,5 mm partikkelstørrelse), enzym lasting (15 mg / g glukan), og hydrolyse tilstander (48 t, 50 ° C). A. Fordøyelse av forskjellige AFEX-forbehandlet underlag med Accellerase 1000. B. Fordøyelse av mais Stover forbehandlet av tre forskjellige metoder med Accellerase 1000 (se Banerjee et al. 2010C).

Figur 2. Optimal proporsjoner av 11 enzymer for utgivelsen av GLC fra AFEX-forbehandlet mais Stover (AFEX-CS), alkalisk hydrogen peroxide-forbehandlet mais Stover (AHP-CS), eller AFEX-forbehandlet tørket destillereERS 'korn (AFEX-DDG). Dataene er hentet fra Banerjee et al. (2010C). Tall langs toppen av barene er GLC gir som en prosent av den totale GLC i biomassen prøven.

Figur 3. A. Bruk av GENPLAT å produsere en optimal blanding av fire kommersielle enzym forberedelsene til utgivelsen av GLC fra AFEX-forbehandlet DDG. Multifect xylanase gjort den minste bidrag (4%) og ble derfor utelatt fra denne trefoldig diagrammet. B. GLC gir fra AFEX-DDG med ulike enzym behandlinger under identiske hydrolyse forhold (15 mg / g glukan enzym, 48 t, 50 ° C) . "Fire-komponent kommersielle" har proporsjonene bestemt fra forsøket vist i fig. 3A.

Discussion

Det er allment anerkjent at å redusere kostnadene av enzymer er viktige for utviklingen av en økonomisk lignocelluloseholdige etanol industrien. Foreløpig tilgjengelig kommersielt enzym cocktails er komplekse og dårlig definerte blandinger av mange proteiner (Nagendran et al., 2009), og de er tilpasset hovedsakelig for bruk på syre-forbehandlet mais Stover. For å akselerere utviklingen av bedre enzym cocktails, har flere laboratorier utviklet high-throughput plattformer for enzym oppdagelse og karakterisering. Innsatsen på dette området har inkorporert en eller flere av følgende egenskaper også funnet i GENPLAT: robot dispensering av enzymer og biomasse slam, statistiske design av eksperiment, og / eller automatisk bestemmelse av GLC og Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. kong et al, 2009).. GENPLAT utvider disse tidligere innsats, mest betydelig i kompleksitet av enzymet blandinger som kan analyseres fra høyst 6 komponenter itidligere studier til mer enn 16 i vår siste arbeid (Banerjee et al. 2010C). Flere viktige funksjoner i GENPLAT er bruk av en perle blandekammer (paddle reservoar) som kan holde Stover slam suspendert under dispensering; skånsom blanding under fordøyelsen ved utgangen-over-end rotasjon, og automatisert kolorimetrisk bestemmelse av Glu og Xyl.