Summary
وقد تم تصميم مفاعل حيوي قادر على الضغط دوري تعريض أنسجة القلب صمام ضغط الظروف الفسيولوجية والمرضية. برنامج يتيح للمستخدمين ابفيو (LabVIEW) للسيطرة على ضغط حجم والسعة والتردد. ويمكن استخدام هذا الجهاز لدراسة mechanobiology من نسيج صمام القلب او خلايا معزولة.
Abstract
الصمام الأبهري ، وتقع بين البطين الأيسر والشريان الأورطي ، ويسمح لتدفق الدم أحادي الاتجاه ، ومنع ارتجاعي في البطين. وتتألف منشورات صمام الشريان الأبهر من الخلايا الخلالي علقت داخل المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتصطف مع الخلايا البطانية أحادي الطبقة. صمام يقاوم قاسية ، بيئة دينامية ويتعرض باستمرار إلى القص ، والانحناء ، والتوتر والضغط. وقد أظهرت الأبحاث الآفات كلسي في الصمامات المريضة تحدث في مناطق التوتر ميكانيكية عالية نتيجة لتعطل أو البطانية الخلالي مصفوفة الضرر 1-3. وبالتالي ، فإنه ليس من المستغرب أن الدراسات الوبائية أظهرت ارتفاع ضغط الدم ليكون عامل خطر رئيسي في ظهور مرض الصمام الأبهر 4.
خيار العلاج الوحيد المتاح حاليا للمرض هو استبدال صمام جراحية لمريضة مع صمام صمام bioprosthetic أو ميكانيكية 5. وتحسين فهم البيولوجيا صمام استجابة للضغوط المادية تساعد في الكشف عن آليات المرضية صمام. في المقابل ، يمكن أن يساعد ذلك في تطوير علاجات غير الغازية مثل التدخل الصيدلانية أو الوقائية. وقد تم تطويره من قبل العديد من المفاعلات الحيوية لدراسة mechanobiology من صمامات القلب الأصلي أو هندسيا 6-9. كما تم تطوير المفاعلات الحيوية نابض لدراسة مجموعة من الأنسجة بما في ذلك الغضروف 10 ، 11 العظام والمثانة 12. كان الهدف من هذا العمل لوضع نظام دوري الضغط التي يمكن استخدامها لتوضيح الاستجابة البيولوجية منشورات صمام الشريان الأبهر للأحمال زيادة الضغط.
يتألف النظام من غرفة الاكريليك التي ترغب في وضع العينات وانتاج ضغط الدوري ، والصمامات اللولبي VITON الحجاب الحاجز للسيطرة على توقيت دورة الضغط وجهاز كمبيوتر للتحكم في الأجهزة الكهربائية. تم رصد الضغط باستخدام محول الضغط ، وكانت مشروطة الإشارة باستخدام مكيفات تحميل الخلية. برنامج ابفيو (LabVIEW) ينظم الضغط باستخدام جهاز تمثيلي على ضخ الهواء المضغوط في النظام بسعر مناسب. تحاكي النظام الحيوي مستويات ضغط transvalvular المرتبطة صمام الشريان الأبهر ، وشهدت موجة الأسنان تنتج زيادة تدريجية في الضغط ، نموذجية من التدرج الضغط transvalvular التي موجود في جميع أنحاء صمام أثناء انبساط ، تليها انخفاض ضغط حاد في تصور فتح صمام انقباضة. يسمح البرنامج للمستخدمين ابفيو (LabVIEW) للتحكم في حجم وتواتر الضغط بصفة دورية. كان النظام قادرا على إخضاع عينات الأنسجة لظروف الضغط والفيزيولوجية المرضية. ويمكن استخدام هذا الجهاز لزيادة فهمنا لكيفية صمامات القلب الاستجابة للتغيرات في البيئة المحلية الميكانيكية.
Protocol
1. حصاد الأنسجة والتحضير
- وينبغي جمع صمامات الأبهر من الخنازير البالغين وزنها لا يزيد عن 120 £ على الفور بعد الموت.
- غسل الصمامات مرتين مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) والنقل إلى المختبر على الجليد.
- يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة.
- تأكد من أن المنشورات لا تظهر أي علامة على انحطاط ، وتمزيق أو التكلس. إزالة المناشير من جذر الأبهر عن طريق قطع 1 / 3 من المسافة من الحلقة.
- منشورات المركز في الآبار الفردية لوحة six جيدا واحتضان بين عشية وضحاها مع متوسطة 3ml Dulbecco في النسر التعديل تستكمل مع حل anti-biotic/anti-mycotic 1 ٪ و 10 ٪ في مصل بقري جنيني من 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- كما يمكن أن تكون بديلا المصنف ، والخلايا المعزولة في لوحات ثقافة ستة جيدا وتستخدم في جهاز الضغط. لا يمكن أن يؤديها عزل الخلايا البطانية وخلايا صمام خلالي كما هو موضح سابقا 13 و 14.
2. الضغط الدراسات
- وقد تم تصميم نظام الضغط مصنوعة خصيصا لدراسة آثار mechanobiological دوري للضغط على أنسجة الصمام الأبهر 15.
- تسجيل الدخول إلى جهاز الكمبيوتر وفتح البرنامج LABVIEW (الشكل 1).
- المعايرة :
- قبل التجريب ، ينبغي أن يكون نظام معايرة بشكل صحيح.
- توصيل التيار الكهربائي إلى لوحة الدائرة. وهذا يوفر الطاقة إلى الملف اللولبي الصمامات التي تتحكم في تدفق الهواء إلى داخل وخارج القاعة.
- تأكد من توصيل الهواء المضغوط للنظام وفتح العرض الجوي لسرعة الكامل.
- تشغيل مكبر إشارة. تأكد من قراءة الجهد هو 0.00. ضبط حسب الضرورة
- واجهة LABVIEW وتبديل وضع علامة "TEST / محضر". تأكد من تعيين رمز التبديل إلى "اختبار". انقر على زر "آير التموين" لفتح صمام الملف اللولبي المدخل.
- باستخدام منظم ضغط الغاز ، مع الضغط على غرفة الهواء المضغوط في 1 PSI. يمكن قراءة الضغط في الغرفة باستخدام مقياس الضغط الرقمي الموجود على الجزء الخلفي نهاية لوحة للغرفة. بمجرد الضغط ومعايرتها وسجل القراءة الجهد من مكبر للصوت إشارة. كرر لPSI 2 و 3 و 4 و 5.
- بناء منحنى معايرة ضغط مقابل الجهد. وينبغي تحويلها إلى ضغوط من PSI مم زئبق. يمكن وضعها في المعادلة من الرسم إلى رمز للبرنامج LABVIEW
- إزالة اللوحة الأمامية الألومنيوم من غرفة الضغط ورش الغرفة مع الايثانول 70 ٪. إجازة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة للسماح للأبخرة الإيثانول المتبقية لتبدد.
- مكان لوحة سداسية كذلك تحتوي على عينات من النشرة الى غرفة واستبدال لوحة أمامية. ضمان الختم هو محكم من خلال تشديد المكسرات الموجودة على قضبان مترابطة four (الموجود في كل زاوية من لوحة النهاية) باليد. المكان غرفة الضغط في الحاضنة 37 درجة مئوية. ويظهر رسم تخطيطي للغرفة الضغط في الشكل 2.
- فإن واجهة المستخدم موجه لتوفير مقدار الوقت دورات النظام بين المدخلات والمخرجات الهواء المضغوط. يجب تعيين هذه إلى و0.6s 0.4s لمحاكاة الظروف الانقباضي الانبساطي و، على التوالي ، على تردد 1Hz. يجب على المستخدم أيضا إدخال مسار ملف البيانات.
- في LABVIEW ، انقر فوق تشغيل وتبديل "TEST / محضر" تبديل إلى "السجل".
- تأكد من أن الضغط على المستوى المطلوب باستخدام الرسم على واجهة LABVIEW. يمكن ضبط الضغط باستخدام منظم ضغط الغاز.
- تشغيل البرنامج لمدة من الوقت المطلوب.
- بمجرد اكتمال التجربة ، انقر فوق الزر إيقاف على LABVIEW ، وإيقاف العرض الجوي وفتح صمام العادم في غرفة الضغط.
- إزالة اللوحة الأمامية من الغرفة وجلب عينات لوحة تحتوي على ستة جيدا. ويمكن الآن أن تحلل عينات للتعبير الجينات ، والتعبير البروتين ، والأنسجة ، الخصائص الميكانيكية الخ.
3. ممثل النتائج :
نظام ضغط قادرة على محاكاة أقصى الضغوط لوحظ تحت transvalvular normotensive ، المرحلة الأولى وارتفاع ضغط الدم ظروف المرحلة الثانية. ومع ذلك ، كان الضغط غير قادرة على محاكاة التدرج الضغط الانقباضي ، وهو أساسا صفر في الجسم الحي. الحفاظ على وتيرة 1Hz ، مع مدخل الهواء 0.6s الوقت والوقت عوادم 0.4s. ويمكن رؤية ممثل الطول الموجي ضغط ظروف الضغط العادية ومرتفعة تم الحصول عليها من هذا النظام في الشكل 3.
الشكل 1 : لقطة الشاشة واجهة ابفيو (LabVIEW).
الشكل 2 : رسم تخطيطي لعرض ألف غرفة الضغط متساوي القياس من غرفة الضغط ؛ باء عرض الجانبية للغرفة الضغط ؛C. عرض أعلى غرفة الضغط.
الشكل 3 : رسم بياني لمحاكاة الضغط داخل حجرة الضغط على (A) normotensive ، (ب) المرحلة الأولى ارتفاع ضغط الدم ، و (C) المرحلة الثانية ظروف ارتفاع ضغط الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتعرض نظام الضغط بنجاح منشورات صمام الشريان الأبهر للضغوط التي كانت ممثلة دوري للضغط الانبساطي transvalvular. ومع ذلك ، فإنه لم يكن قادرا على محاكاة الضغط الانقباضي transvalvular ، كما انخفض ضغط فقط إلى 40 مم زئبق. الضغط Transvalvular هو الفرق بين الضغط في الأبهر الصاعد والبطين الأيسر. أثناء انبساط ، وعندما يتم إغلاق صمام ، والفرق هو الضغط 80mmHg في ظل ظروف وnormotensive زئبق 90 و 100mmHg في المرحلة الأولى والمرحلة الثانية ارتفاع ضغط الدم ، على التوالي. أثناء انقباض ، عندما صمام مفتوح ، والفرق بين الضغط في البطين الأيسر والشريان الأبهر الصاعد هو صفر. ويعتقد أن التغيرات الخلوية التي تحدث في مرض الصمام الأبهر لتترافق مع ارتفاع ضغط الدم الانبساطي ، وبالتالي ، فإن الضغط الواقع لم ينخفض إلى الصفر قد لا يكون مصدر قلق كبير. ويستند هذا على افتراض أنه هو حجم الضغط وعدم الضغط السعة التي هي القوة الدافعة وراء الاستجابات البيولوجية. تخفيف الضغط من 100 مم زئبق إلى 0 مم زئبق يتطلب 1،20 ± 0.04s ، أفاد من تحليل البيانات من دورات ضغط 20. منذ فترة من الوقت يتم إغلاق الصمام الأبهر ما يقرب من 2 / 3 من دورة القلبية ، فإن تدفق الهواء في حجرة الضغط تتطلب 2.4s لخلق التوازن نفسه على فتح وإغلاق صمام خبرة في الظروف الفسيولوجية. ونتيجة لذلك ، يمكن استخدام تردد 0.28 هرتز لاختبار آثار كلا الانقباضي والانبساطي مستويات ضغط على transvalvular mechanobiology صمام الشريان الأبهر. ومع ذلك ، يمكن إذا كانت كل الضغط الانقباضي والانبساطي transvalvular أن تكون محاكاة على تردد الفسيولوجية من 1 هرتز ، ومضخة وخزان فراغ يمكن تركيبها على العادم صمام الملف اللولبي. يمكن وضع مضخة فراغ لإزالة كمية محددة من الضغط وذلك عندما يفتح صمام العادم ، سوف يمكن استخلاصها من كمية الهواء المطلوبة للحد من الضغوط تماما من تعيين مستوى الضغط في المكمن فراغ. فإن إزالة الضغط خلق بيئة زئبق 0 ، مرادفا للضغط الانقباضي transvalvular. على العكس ، عندما يغلق صمام العادم ، والفراغ لم تعد تؤثر في الغرفة ، وسيسمح لزيادة الضغط عن طريق الهواء المضغوط. بالإضافة إلى استخدام مضخة فراغ لمحاكاة أقرب الظروف الفسيولوجية ، يمكن استخدام صمام العادم مع أكبر قطرها إلى انخفاض الضغط داخل مفاعل حيوي بسرعة أكبر. حاليا ، 3 / 8 "قطرها العادم صمام الملف اللولبي لديه معدل تدفق 3.3 غالون في الدقيقة (عند 60 درجة فهرنهايت ، الثقل النوعي لل1) ، في حين ، وهي صمام العادم مع 2" قطر لديها معدل تدفق 28.0 غالون دقيقة واحدة. وقطر أكبر صمام الملف اللولبي هو أكثر فعالية من حيث التكلفة من استخدام مضخة فراغ ، ولكن قد لا يكون قادرا على الإفلات من الضغوط تماما الى الصفر في نطاق الفسيولوجية ، وينبغي بالتالي المزيد من التحقيق. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة الملف اللولبي الصمامات عدة ناجمة عن الدائرة نفسها التي تحكم مفتوحة في نفس الوقت ، وبالتالي "موازية تجهيز" تدفق الغاز.
ويمكن تشغيل النظام باستخدام باستمرار في المنزل الهواء المضغوط. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن التغيرات الحادة في الجينات والتعبير البروتين يمكن أن يحدث في غضون 16 ساعة ، 17. ومع ذلك ، قد لا تكون هذه المدة كافية لدراسة الجينات العابرة / البروتين التعبير أو تغيرات في النمط الظاهري الخلوية نتيجة لإجهاد ميكانيكي. العيب في استخدام الهواء المضغوط هو ان الغاز لا يحتوي على 5 ٪ CO 2 ، وهو أمر مهم للتحكم في درجة الحموضة من المتوسط الثقافة. ويمكن التغلب على ذلك عن طريق إضافة hepes العازلة إلى المتوسط. أيضا ، وخلايا تنتج ثاني أكسيد الكربون (2) ، منتج النفايات الأيضية. وإفراز أكسيد الكربون 2 من الأنسجة أيضا منع المتوسطة تصبح الأساسية.
بالإضافة إلى اختبار صمامات الأبهر عند ضغوط مختلفة ، قد يكون من الحكمة لدراسة الآثار المترتبة على اختلاف الترددات كذلك. على سبيل المثال ، يمكن للآثار التغيرات في معدل ضربات القلب قبل وأثناء وبعد الجراحة توضيح التغيرات في تعبير البروتين داخل الصمام. عدم انتظام ضربات القلب بعد الجراحة تحدث في ما يصل الى 20 ٪ من المرضى 18-21. برنامج ابفيو (LabVIEW) المستخدمة لهذا النظام يسمح للمستخدم أن يختار طول الوقت يدخل الهواء ويترك الغرفة ، وبالتالي ، يمكن بسهولة تكرار دورة تعديلها. جهاز يسمح للتردد أقصى 1.5Hz (90bpm) نظرا لكمية الوقت اللازم لاستنفاد ضغوط من القاعة. كما رأينا في الشكل 3 ، بإنخفاض ضغط كبرى وقعت في 0.2s الأولى بعد التنشيط صمام العادم ، ثم تراجعت تدريجيا إلى الضغط المتبقية لل0.2s المتبقية من العادم. كان هبوط الضغط المتوسط في 0.2s الأولي من العادم 45.8 ± 0.34mmHg ، ويقاس على مدى دورات ضغط 20. نظرا إلى أن اختبار المرحلة الثانية ظروف ارتفاع ضغط الدم يتطلب سوى الضغط الدراجات بين 6-10 ملم زئبقي على الأقل ، تردد 1.5 هرتز يسمح لل0.22s العادم ، والذي هو تيم وافرةه لإسقاط 40 مم زئبقي للضغط. إذا تم إرفاق مضخة فراغ لصمام العادم ، ويمكن أن تسهل أسرع هبوط في الضغط وسيسمح اختبار العالي التردد. لا يقتصر على الحد الأدنى من التردد مفاعل حيوي ، ولكن بسبب الضغط المنظم قد تسمح بتدفق الهواء من بطء وصمام العادم سيكون لديه الوقت الكافي لإسقاط الضغط داخل المفاعل.
في الختام ، تم بناؤها على نظام الثقافة العقيمة للسماح الدراسة المجراة سابقا من القلب الأورطي الخنزيري mechanobiology صمام. تدوير الضغط داخل مفاعل حيوي بين مستويات ضغط الدم الانبساطي transvalvular عن الظروف الفسيولوجية والمرضية. لتلبية متطلبات النظام ، كان مفاعل صغير الحجم ويمكن بالتالي أن تكون الواردة ضمن حاضنة مرطب للحفاظ على حرارة الأنسجة عند 37 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك ، كانت تسيطر على حجم الضغط والتردد بشكل مستقل ، مما يسمح بدراسة مجموعة واسعة من الشروط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون لSchipke شاد وChesser دانيال لمساعدتهم في تصميم وتصنيع هذا النظام ومايلز Valtresa للمساعدة في إعداد مخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
