Summary
Um biorreator pressão cíclica capaz de submeter o tecido de válvula cardíaca em condições de pressão fisiológicos e patológicos tem sido projetado. Um programa LabVIEW permite aos usuários controlar a pressão magnitude amplitude e frequência. Este dispositivo pode ser usado para estudar a mechanobiology do tecido cardíaco válvula ou células isoladas.
Abstract
A valva aórtica, localizada entre o ventrículo esquerdo ea aorta, permite um fluxo unidirecional do sangue, impedindo o refluxo para o ventrículo. Folhetos da válvula aórtica são compostas de células intersticiais suspenso dentro de uma matriz extracelular (ECM) e são revestidas com uma monocamada de células endoteliais. A válvula resiste a um ambiente adverso e dinâmico e está constantemente exposto ao cisalhamento, flexão, tensão e compressão. A pesquisa mostrou lesões calcificadas em válvulas doentes ocorrer em áreas de alta resistência mecânica, como resultado do rompimento ou dano endotelial matriz intersticial 1-3. Por isso, não é surpreendente que estudos epidemiológicos têm demonstrado a pressão arterial elevada ser um factor de risco mais importante no aparecimento da doença da válvula aórtica 4.
A única opção de tratamento atualmente disponíveis para a doença da válvula é a substituição cirúrgica da valva doente com uma válvula de prótese biológica ou mecânica 5. Melhor compreensão da biologia da válvula em resposta ao stress físico ajudaria a elucidar os mecanismos de patogênese da válvula. Por sua vez, isso poderia ajudar no desenvolvimento de terapias não invasivas, como a intervenção farmacêutica ou de prevenção. Biorreatores várias tenham sido previamente desenvolvidos para estudar a mechanobiology de válvulas cardíacas nativas ou engenharia 6-9. Biorreatores pulsátil também têm sido desenvolvidos para estudar uma variedade de tecidos, incluindo cartilagens 10, 11 e osso da bexiga 12. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de pressão cíclica que poderia ser usado para elucidar a resposta biológica de folhetos da válvula aórtica a cargas de maior pressão.
O sistema consistia de uma câmara de acrílico para colocar as amostras e produzir pressão cíclica, válvulas de diafragma viton solenóide para controlar o tempo do ciclo de pressão, e um computador para controle de dispositivos elétricos. A pressão foi monitorada através de um transdutor de pressão, eo sinal foi condicionado usando um condicionador de célula de carga. Um programa LabVIEW regulamentou a pressão utilizando um dispositivo analógico para bombear o ar comprimido para o sistema a uma taxa apropriada. O sistema imitou a dinâmica dos níveis de pressão transvalvar associado com a válvula aórtica, uma onda dente de serra produziu um aumento gradual na pressão, típico do gradiente de pressão transvalvar que está presente através da válvula durante a diástole, seguido por uma acentuada queda de pressão mostrando abertura da válvula em sístole. O programa permitiu que os usuários LabVIEW para controlar a magnitude ea freqüência de pressão cíclica. O sistema foi capaz de submeter amostras de tecido para condições de pressão fisiológicos e patológicos. Este dispositivo pode ser usado para aumentar a nossa compreensão de como válvulas cardíacas responder às mudanças no ambiente local mecânica.
Protocol
1. Colheita e Preparação dos tecidos
- Valva aórtica devem ser coletadas de suínos adultos pesando não mais de £ 120 imediatamente após a morte.
- Lavar as válvulas duas vezes com solução salina tamponada estéril de fosfato (PBS) e transporte para o laboratório em gelo.
- Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados em condições estéreis.
- Assegurar que os folhetos não mostram qualquer sinal de degeneração, rasgar ou calcificação. Remover folhetos a partir da raiz da aorta, cortando 1 / 3 da distância entre o anel.
- Folhetos lugar em poços individuais de uma placa de seis poços e incubar durante a noite com média de 3 ml de Dulbecco Modificado Águia suplementado com 1% de solução anti-biotic/anti-mycotic e 10% de soro fetal bovino a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Como alternativa, células isoladas podem ser semeados em placas de seis cultura e bem utilizada no dispositivo de pressão. Isolamento de células endoteliais e válvula de células intersticiais podem ser realizados conforme descrito anteriormente 13, 14.
2. Estudos pressão
- Um sistema de pressão feito por encomenda foi projetado para estudar os efeitos de pressão cíclica mechanobiological em tecido de válvula aórtica 15.
- Faça logon no computador e abra o programa LabVIEW (Figura 1).
- Calibração:
- Antes da experimentação, o sistema deve estar devidamente calibrado.
- Ligue o fornecimento de energia para a placa de circuito. Esta fornece energia para as válvulas solenóides que controlam o fluxo de ar para dentro e para fora da câmara.
- Verifique se o ar comprimido é conectado ao sistema e abrir o suprimento de ar à velocidade total.
- Ligar o amplificador de sinal. Certifique-se a leitura da tensão é de 0,00. Ajustar conforme necessário
- A interface LabVIEW tem um interruptor marcado "TEST / RECORD". Verifique se a chave é definido como "TEST". Clique no botão "Air Supply" para abrir a válvula solenóide de entrada.
- Usando o regulador de pressão de gás, pressurizar a câmara com ar comprimido a um PSI. A pressão na câmara pode ser lido através do indicador de pressão digital localizado na parte traseira de placa terminal da câmara. Uma vez que a pressão tem equilibrado, gravar a leitura da tensão do amplificador de sinal. Repita o procedimento para PSI 2, 3, 4 e 5.
- Construir uma curva de calibração de pressão versus tensão. A pressão deve ser convertido de PSI para mmHg. A equação do gráfico pode ser colocado no código do programa LabVIEW
- Remova a placa frontal de alumínio da câmara de pressão e pulverizar a câmara com etanol 70%. Deixe por um mínimo de 10 minutos para permitir que vapores de etanol residual a se dissipar.
- Coloque a placa de seis poços contendo as amostras de folheto para a câmara e substituir a placa dianteira. Garantir a vedação é hermética, apertando as porcas localizados nas quatro hastes rosqueadas (localizado em cada canto da placa de final) com a mão. Coloque a câmara de pressão nos 37 ° C incubadora. Um diagrama esquemático da câmara de pressão é mostrado na figura 2.
- A interface irá solicitar ao usuário para fornecer a quantidade de tempo que o sistema de ciclos entre entrada de ar comprimido e de saída. Estes devem ser definidos para 0.6s e 0.4s para imitar as condições diastólica e sistólica, respectivamente, a uma freqüência de 1Hz. O usuário também deve inserir um caminho de arquivo de dados.
- No LabVIEW, clique em Executar e mudar o "TEST / RECORD" alternar para "RECORD".
- Certifique-se que a pressão está no nível desejado usando o gráfico na interface do LabVIEW. Pressão pode ser ajustado com o regulador de pressão de gás.
- Executar o programa de período de tempo desejado.
- Uma vez que a experiência é completa, clique no botão parar em LabVIEW, desligue a alimentação de ar e abrir a válvula de escape na câmara de pressão.
- Remova a placa frontal da câmara e recuperar amostras de seis bem placa contendo. Amostras podem agora ser analisados para a expressão do gene, a expressão da proteína, histologia, propriedades mecânicas, etc
3. Resultados representativos:
O sistema de pressão é capaz de simular as pressões máxima transvalvar observado sob normotensos, estágios I e II condições hipertensos. No entanto, a pressão não foi capaz de imitar o gradiente de pressão sistólica, que é essencialmente zero in vivo. Freqüência é mantida em 1Hz, com um tempo de entrada de ar 0.6s e um tempo de escape de 0.4s. Pressão representante formas de onda de condições normais de pressão e elevada obtidos a partir do sistema pode ser visto na figura 3.
Figura 1: Captura de tela da interface do LabVIEW.
Figura 2: Desenho esquemático da câmara de pressão de vista Isometric A. da câmara de pressão; B. Vista lateral da câmara de pressão;C. Vista superior da câmara de pressão.
Figura 3: Gráfico de simulação de pressão dentro da câmara de pressão (A) normotensos, (B) Fase I hipertensos, e (C) Estágio II condições hipertensos.
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Discussion
O sistema de pressão com sucesso expostos folhetos da válvula aórtica a pressões cíclicas que eram representativas de pressão transvalvar diastólica. No entanto, não foi capaz de imitar a pressão sistólica transvalvar, como a única pressão caiu para 40 mmHg. Pressão transvalvar é a diferença entre a pressão na aorta ascendente e do ventrículo esquerdo. Durante a diástole, quando a válvula é fechada, a diferença de pressão é 80mmHg em condições normotensos e 90 mmHg e 100 mmHg na fase I e hipertensão estágio II, respectivamente. Durante a sístole, quando a válvula está aberta, a diferença de pressão entre o ventrículo esquerdo ea aorta ascendente é zero. As alterações celulares que ocorrem na doença da válvula aórtica são acreditados para ser associado com a pressão diastólica elevada e, portanto, o fato de a pressão não caiu a zero pode não ser uma grande preocupação. Isto é baseado no pressuposto de que é magnitude de pressão e amplitude de pressão que não é a força motriz por trás das respostas biológicas. Reduzir a pressão de 100 mmHg a 0 mmHg requer 1,20 ± 0.04s, relatou a partir de análise de dados de 20 ciclos de pressão. Como a quantidade de tempo que a válvula aórtica está fechada é de aproximadamente 2 / 3 do ciclo cardíaco, o fluxo de ar na câmara de pressão exigiria 2.4s para criar o mesmo equilíbrio de abertura da válvula e fechando com experiência em condições fisiológicas. Como resultado, uma freqüência de 0,28 Hz seria usado para testar os efeitos de ambas as pressões sistólica e diastólica níveis de pressão transvalvar aórtica em mechanobiology válvula. No entanto, se ambas as pressões sistólica e diastólica transvalvar devem ser simulados em uma freqüência de 1 Hz fisiológicas, uma bomba de vácuo e reservatório poderia ser instalado a válvula solenóide de escape. A bomba de vácuo pode ser configurado para remover uma quantidade fixa de pressão por isso, quando a válvula de escape se abre, a quantidade de ar necessário para reduzir completamente a pressão do nível de pressão de ajuste seriam atraídos para o reservatório de vácuo. A remoção da pressão criaria um ambiente mmHg 0, sinônimo de pressão sistólica transvalvar. Inversamente, quando a válvula de escape fecha, o vácuo não afetarão mais a câmara e permita que a pressão aumente via ar pressurizado. Além de usar uma bomba de vácuo para mais perto imitar as condições fisiológicas, uma válvula de escape com um diâmetro maior pode ser usado para descartar a pressão dentro do biorreator mais rapidamente. Atualmente, a 3 / 8 "de diâmetro válvula solenóide de escape tem uma vazão de 3,3 litros por minuto (a 60 ° F gravidade específica de 1) e que, uma válvula de escape com um diâmetro de 2" tem uma vazão de 28,0 litros por minuto. Uma válvula de solenóide de maior diâmetro é mais rentável do que usar uma bomba de vácuo, no entanto, pode não ser capaz de queda de pressão completamente a zero dentro da faixa fisiológica e deve ser investigada. Alternativamente, válvulas solenóides várias desencadeada pelo circuito de controle mesmo que se abrem simultaneamente poderiam ser acrescentados, assim, "processamento paralelo" saída do gás.
O sistema pode ser operado de forma contínua utilizando in-house de ar comprimido. Estudos anteriores demonstraram que alterações agudas no gene e expressão da proteína pode ocorrer dentro de duas horas 16, 17. No entanto, esta duração não pode ser suficiente para estudar a expressão do gene / proteína transitória ou mudanças no fenótipo celular, como resultado do estresse mecânico. A desvantagem de usar o ar comprimido é que o gás não contém 5% de CO 2, o que é importante para controlar o pH do meio de cultura. Isso pode ser superado pela adição de tampão HEPES ao meio. Além disso, as células produzem CO 2 como um produto de resíduos metabólicos. Secreção de CO 2 a partir do tecido também irá evitar que o meio se tornar básica.
Além de testar as válvulas aórtica em pressões diferentes, pode ser prudente para estudar os efeitos de diferentes freqüências também. Por exemplo, os efeitos das alterações na freqüência cardíaca antes, durante e depois da cirurgia poderiam elucidar mudanças na expressão de proteínas dentro da válvula. Arritmias pós-operatórias ocorrem em até 20% dos pacientes 18-21. O programa LabVIEW usado para este sistema permite ao usuário escolher a duração do tempo do ar entra e sai da câmara e, portanto, a freqüência do ciclo pode ser facilmente ajustado. O dispositivo permite uma freqüência máxima de 1,5 Hz (90bpm), devido à quantidade de tempo necessário para esgotar a pressão da câmara. Como visto na Figura 3, uma diminuição da pressão maior ocorreu na primeira 0.2s após a ativação da válvula de escape, então, gradualmente, se recusou a pressão residual para a 0.2s restante do escape. A queda de pressão média no 0.2s inicial de escape foi de 45,8 ± 0.34mmHg, medido mais de 20 ciclos de pressão. Dado que os testes de condições Stage II hipertensos requer apenas a pressão de ciclagem entre pelo menos 6-10 mmHg, a freqüência de 1,5 Hz permite 0.22s de escape, que é tim amplae à queda de 40 mmHg de pressão. Se uma bomba de vácuo está ligado à válvula de escape, poderia facilitar uma rápida queda de pressão e teste permitiria maior freqüência. A frequência mínima do biorreator não se limita, no entanto, porque o regulador de pressão poderia permitir fluxo lento de ar ea válvula de escape teria tempo suficiente para a queda de pressão dentro do reator.
Em conclusão, um sistema de cultura estéril, foi construído para permitir o estudo ex vivo de suínos mechanobiology válvula aórtica do coração. A pressão dentro do biorreator ciclo entre os níveis de pressão diastólica transvalvar de condições fisiológicas e patológicas. Para atender aos requisitos do sistema, o biorreator foi compacto e poderia, portanto, ser contido dentro de uma incubadora umidificada para manter a temperatura do tecido, a 37 ° C. Além disso, a magnitude da pressão e freqüência foram controlados de forma independente, permitindo uma ampla gama de condições a serem estudados.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores são gratos a Shad Schipke Chesser e Daniel para a sua assistência com o design e fabricação do sistema e Myles Valtresa de assistência com a preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
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