Summary
Циклических биореактора давление способен подчинять ткань сердечного клапана для физиологических и патологических состояний давления был разработан. Программа LabVIEW позволяет пользователям контролировать давление величины амплитуды и частоты. Это устройство может быть использовано для изучения mechanobiology сердечной ткани клапана или изолированные клетки.
Protocol
1. Урожай тканей и подготовка
- Аортального клапана должны быть собраны от взрослых свиней весом не более 120 фунтов сразу после смерти.
- Вымойте клапаны дважды стерильными фосфатным буферным раствором (PBS) и транспорт в лабораторию на льду.
- Все последующие шаги должны выполняться в стерильных условиях.
- Убедитесь, что листовки не показывают никаких признаков дегенерации, разрывая или кальцификации. Удалить листовки от корня аорты за счет сокращения 1 / 3 от расстояния от кольца.
- Место листовки в отдельных скважинах шесть хорошо пластины и инкубировать в течение ночи с 3 мл изменения Дульбеко Eagle среде, дополненной 1% anti-biotic/anti-mycotic решения и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37 ° С и 5% СО 2.
- В качестве альтернативы, изолированные клетки могут быть посеяны на шесть-луночных культуры и используются в давлении устройства. Изоляция клапана эндотелиальные клетки и интерстициальные клетки могут быть выполнены, как описано выше 13, 14.
2. Давление исследований
- Заказные давление в системе был разработан для изучения mechanobiological эффекты циклических давление на ткани клапана аорты 15.
- Войдите на компьютер и открыть программу LabVIEW (рис. 1).
- Калибровка:
- До экспериментов, система должна быть правильно откалиброван.
- Подключение питания к плате. Это обеспечивает питание для электромагнитных клапанов, которые контролируют поток воздуха в и из камеры.
- Убедитесь в том, сжатый воздух, подключенных к системе и открытых подачи воздуха к полной скорости.
- Включите усилитель сигнала. Убедитесь, что напряжение чтение 0,00. Отрегулируйте при необходимости
- LabVIEW интерфейс переключатель, обозначенный "ТЕСТ / RECORD". Убедитесь, что переключатель установлен в положение "TEST". Нажмите кнопку "Подача воздуха", чтобы открыть впускной клапан соленоида.
- Использование регулятора давления газа, давление в камере с помощью сжатого воздуха на 1 PSI. Давление в камере можно читать с помощью цифровой манометр, расположенный на задней концевой пластинки из камеры. Как только давление уравновешенной, запись напряжения чтении из усилителя сигнала. Повторите эти действия для 2, 3, 4 и 5 PSI.
- Построить калибровочную кривую давления от напряжения. Давление должно быть преобразован из PSI в мм рт. Уравнение из графика могут быть помещены в код программы LabVIEW
- Удалить алюминиевая пластина фронт от барокамеры и брызг камера с 70% этанола. Оставьте на минимум 10 минут, чтобы дать остаточных паров этанола, чтобы рассеять.
- Место шестью лунками содержащего листовки образцов в камере и заменить переднюю панель конца. Обеспечить уплотнение герметичной, затянув гайки расположен на четыре резьбовых шпилек (расположенный на каждом углу в конце пластины) вручную. Место барокамере в 37 ° С инкубатор. Схема барокамере показано на рисунке 2.
- Интерфейс предложит пользователю предоставить количество времени система циклов между сжатого воздуха на входе и выходе. Они должны быть установлены в 0.6s и 0.4, чтобы имитировать диастолического и систолического условиях, соответственно, при частоте 1 Гц. Пользователь должен также ввести путь файла данных.
- В LabVIEW, выберите пункт Выполнить и переключиться "ТЕСТ / RECORD" переключения на "ЗАПИСЬ".
- Убедитесь, что давление на нужном уровне, используя график на интерфейс LabVIEW. Давление можно настроить с помощью регулятора давления газа.
- Запустить программу для достижения желаемого отрезка времени.
- Как только эксперимент завершен, нажмите кнопку остановки на LabVIEW, отключить подачу воздуха и открытой выпускной клапан на барокамеру.
- Снимите переднюю панель конца из камеры и получить шесть-луночного планшета с образцами. Образцы теперь могут быть проанализированы на экспрессию генов, экспрессия белка, гистология, механические свойства и т.д.
3. Представитель Результаты:
Давление в системе имитировать максимальная transvalvular давления наблюдается при нормотензивных, этапе я и II стадии гипертонической условиях. Тем не менее, давление не способны имитировать градиент систолического давления, которое практически равно нулю в естественных условиях. Частота поддерживается на уровне 1 Гц, с эфирного времени на входе 0.6s и выхлопных время 0.4. Представитель давление сигналов нормального и повышенного давления условия, полученные из системы можно увидеть на рисунке 3.
Рисунок 1: Снимок интерфейса LabVIEW.
Рисунок 2: Схематическое изображение барокамере А. Изометрические зрения барокамере, Б. Вид сбоку камеры давления;С. Вид сверху барокамере.
Рисунок 3: График давление моделирования в барокамере при () с нормальным артериальным давлением, (B) I этап гипертонической и (С) II стадия гипертонической условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Давление в системе успешно выставляются аортального клапана листовки циклическим давлением, которые были представитель диастолического transvalvular давления. Тем не менее, она не смогла, чтобы имитировать систолического transvalvular давления, как только давление упало до 40 мм рт. Transvalvular давление это разница между давлением в восходящей аорты и левого желудочка. Во время диастолы, когда клапан закрыт, перепад давления 80mmHg под нормотензивных условиях и 90 мм рт.ст. и 100mmHg в этапе я и II стадии гипертонии, соответственно. Во время систолы, когда клапан открыт, разность давлений между левого желудочка и восходящей аорты равна нулю. Клеточные изменения, которые происходят в аортального клапана заболевание, как считается, связаны с высоким диастолическим давлением, поэтому тот факт, давление не упадет до нуля, не может быть серьезной проблемой. Это основано на предположении, что величина давления, а не амплитудой давления, что является движущей силой биологические реакции. Уменьшение давления от 100 мм рт.ст. до 0 мм рт.ст. требует 1,20 ± 0.04s, сообщила по данным анализа 20 циклов давления. Так как количество времени аортальный клапан закрыт примерно 2 / 3 от сердечного цикла, приток воздуха в барокамере потребует 2.4s создать такой же баланс клапан открытия и закрытия опыт в физиологических условиях. В результате, частота 0,28 Гц будет использоваться для тестирования влияние как систолического и диастолического transvalvular уровней давления на mechanobiology клапана аорты. Однако, если как систолического и диастолического давления transvalvular должны быть смоделированы при физиологической частотой 1 Гц, вакуумный насос и резервуар может быть установлен на клапан выхлопа. Вакуумный насос может быть установлен, чтобы удалить фиксированная сумма в размере давление так, когда открывается выпускной клапан, количество воздуха, необходимого для полного снижения давления от уровня давления срабатывания бы быть вовлечены в вакуумный резервуар. Снятия давления создаст 0 мм рт.ст. окружающей среды, синонимом давление систолическое transvalvular. И наоборот, когда выпускной клапан закрывается, вакуумная больше не влияет на камеру и позволит увеличить давление с помощью сжатого воздуха. Помимо использования вакуумного насоса к более тесному имитировать физиологическое состояние, выпускной клапан большего диаметра может быть использована для падения давления в биореакторе быстрее. В настоящее время 3 / 8 "Диаметр выхлопной электромагнитный клапан имеет расход 3,3 литров в минуту (при 60 ° С, удельный вес 1), тогда как выпускной клапан с 2" диаметром имеет расход 28,0 галлонов минуту. Больше диаметра клапана соленоида является экономически более эффективным, чем при использовании вакуумного насоса, однако он не сможет отказаться от давления полностью до нуля в течение физиологического диапазона и поэтому должны быть предметом дальнейшего расследования. Кроме того, несколько клапанов вызвано той же цепи управления, которые открываются одновременно можно было бы добавить, тем самым "параллельных вычислений" истечения газа.
Система может работать непрерывно использованием внутренних сжатого воздуха. Предыдущие исследования показали, что резкие изменения в генной экспрессии белка и может произойти в течение двух часов, 16, 17. Тем не менее, эта продолжительность не может быть достаточным для изучения переходных ген / экспрессии белка или изменений в клеточных фенотипа в результате механического напряжения. Недостатком использования сжатого воздуха является то, что газ не содержит 5% CO 2, что важно для контроля рН культуральной среды. Эту проблему можно решить путем добавления HEPES буфера в среду. Кроме того, клетки вырабатывают CO 2, как метаболический продукт отходов. Секреция СО 2 из тканей, а также предотвратит среда становится основной.
В дополнение к тестированию аортального клапана при различных давлениях, может быть целесообразно для изучения воздействия различных частот, а также. Например, влияние изменений частоты сердечных сокращений до, во время и после операции может выяснить изменения в экспрессии белка внутри клапана. Послеоперационные аритмии возникают у 20% пациентов 18-21. Программа LabVIEW для этой системы позволяет пользователю выбрать период времени воздух входит и выходит из камеры, поэтому частота цикла можно легко настроить. Устройство позволяет максимальная частота 1.5Hz (90bpm) из-за количества времени, необходимого для выхлопных давление из камеры. Как видно на рисунке 3, значительное сокращение давления произошло в первую 0,2 с после активации выхлопной клапан, а затем постепенно снизился до остаточного давления на оставшиеся 0,2 из выхлопной трубы. Средний перепад давления в начальный 0,2 выхлопных был 45,8 ± 0.34mmHg, измеренные в течение 20 циклов давления. Учитывая, что тестирование Стадия II гипертонической условиях требует только циклическое изменение давления между, как минимум 60-100 мм рт.ст., частотой 1,5 Гц позволяет 0.22s для выхлопных газов, которая является достаточно тиме до 40 мм рт.ст. падение давления. Если вакуумного насоса крепится к выхлопной клапан, он может способствовать более быстрому падению давления и позволит более высокой частоты тестирования. Минимальная частота биореактора не ограничивается, однако, поскольку регулятор давления может позволить медленный приток воздуха и выпускной клапан будет иметь достаточно времени, чтобы падение давления в реакторе.
В заключение стерильной системе культуры был построен, чтобы бывшие изучение естественных свиного аортального клапана сердца mechanobiology. Давление в биореакторе циклически между диастолическим transvalvular уровней давления для физиологических и патологических состояний. Чтобы удовлетворить требования к системе, биореактор был компактным и поэтому могут содержаться в увлажненном инкубаторе для поддержания температуры тканей при температуре 37 ° C. Кроме того, величины напряжения и частоты были управляться независимо, что позволяет широком диапазоне условий будут изучены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Шад Schipke и Даниэль Чессер за их помощь в проектировании и изготовлении систем и Valtresa Майлс за помощь в подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
