Summary
Este artigo apresenta os protocolos de sinais ópticos intrínsecos e flavoproteínas imagem sinais autofluorescência para mapear odor evocadas atividades na superfície do bulbo olfatório em ratos.
Abstract
No cérebro, a estimulação sensorial ativa populações de neurônios distribuída entre os módulos funcionais que participam com a codificação do estímulo. Funcionais técnicas de imageamento óptico são vantajosas para visualizar a ativação destes módulos no córtex sensorial com alta resolução espacial. Neste contexto, endógena sinais ópticos que surgem a partir de mecanismos moleculares ligados à neuroenergetics são fontes valiosas de contraste para gravar mapas espaciais de estímulos sensoriais sobre os campos de largura no cérebro de roedores.
Aqui, apresentamos duas técnicas com base nas alterações de propriedades ópticas endógena do tecido cerebral durante a ativação. Primeiro os sinais ópticos intrínsecos (IOS) são produzidos por uma alteração local na reflexão da luz vermelha devido a: (i) absorção por alterações no nível de oxigenação do sangue eo volume de sangue (ii) dispersão de fótons. O uso de in vivo IOS para gravar mapas espaciais começou em meados de 1980 com o observatina óptica de mapas de barris whisker no rato e as colunas de orientação do córtex visual do gato 1. IOS imagem da superfície do roedor bulbo olfatório (OB), em resposta a odores mais tarde foi demonstrado pelo grupo de Larry Katz 2. A segunda abordagem se baseia em sinais flavoproteína autofluorescência (FAS), devido a mudanças no estado redox desses intermediários metabólicos mitocondrial. Mais precisamente, a técnica é baseada na fluorescência verde devido ao estado oxidado de flavoproteínas quando o tecido está animado com luz azul. Embora tais sinais estavam provavelmente entre as primeiras moléculas fluorescentes gravadas para o estudo da atividade cerebral pelos estudos pioneiros de Chances Britton e colegas 3, não foi até recentemente que eles têm sido usados para o mapeamento de ativação do cérebro in vivo. FAS imagem foi aplicada pela primeira vez para o córtex somatossensorial em roedores, em resposta à estimulação pata traseira por grupo Katsuei Shibuki 4.
O sistema olfativo é de importância central para a sobrevivência da grande maioria das espécies vivas, pois permite a detecção eficiente e identificação de substâncias químicas no ambiente (comida, predadores). O OB é o primeiro relé de processamento da informação olfativa do cérebro. Que recebe projeções aferentes do olfactory principal neurônios sensoriais que detectam as moléculas de odores voláteis. Cada neurônio sensorial expressa apenas um tipo de receptor de odorante e neurônios transportando o mesmo tipo de receptor envia seus processos de nervo para o mesmo bem definido microrregiões de ~ 100μm constituído de três neuropil discreta, o glomérulo olfatório (Fig. 1). Na última década, imagem IOS tem fomentado a exploração funcional do OB 5, 6, 7, que se tornou uma das estruturas mais estudadas sensorial. O mapeamento da atividade OB com FAS imagem não foi realizada ainda.
Aqui, we mostrar as etapas sucessivas de um protocolo eficiente para IOS e imagem FAS para mapear odor evocadas atividades no OB mouse.
Protocol
1. Preparar o animal para geração de imagens (de acordo com recomendações europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório, a Directiva 86/609/CEE)
- 6 a 8 semanas de idade C57BL6 camundongos machos são anestesiados com uma mistura de quetamina (10mg/kg) e xilazina (100mg/kg) injetados intraperitonealmente. Cirurgia começa quando o mouse não responde mais à pata traseira pinch. Durante todo o experimento o animal é colocado em uma almofada de aquecimento. Temperatura do corpo é continuamente monitorizada e mantida a 37 ° C. Profundidade da anestesia é mantida durante toda a cirurgia e sessões de imagens por verificar a ausência de membro se retirar. A injecção subcutânea de 20% do cocktail anestésico inicial é administrados por outra via.
- Usando clippers, remover os pêlos do couro cabeludo. Limpe a pele exposta do cabelo residual usando gaze estéril embebida em soro fisiológico.
- Posicione o mouse no quadro estereotáxico. O focinho tem de ser no mesmo plano que a parte de trás da cabeça,, a fim de definir a superfície do bulbo olfativo com a horizontal. Segura firmemente ouvido do nariz e bares, a fim de impedir os movimentos durante o exame.
- Aplicar pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem e dor.
- Desinfectar todos os instrumentos cirúrgicos com etanol 70 ° e na área do couro cabeludo com varreduras sucessivas de betadine.
- Para remover a pele que cobre o crânio, começar por fazer uma incisão na pele com uma tesoura na parte de trás da cabeça entre as orelhas. Em seguida, corte em ambos os lados em direção à base da orelha e no sentido ântero-posterior para a testa ao longo das pálpebras. Terminar de remover o couro cabeludo, cortando a pele em cima do focinho perto do bar nariz.
- Sob observação binocular, use um cotonete embebido em soro fisiológico para retirar delicadamente o periósteo na parte superior do crânio. Use uma pinça para remover o tecido remanescente e raspe a superfície do crânio com um bisturi para ter uma preparação limpo.
- O OB é uma estrutura simétrica composta de duas hemibulbs que estão localizados entre as pálpebras. Eles são limitados no rostral e na direção caudal por um seio venoso, e separados pela sutura sagital. Coloque um pedaço de esponja de gelatina absorvível embebida com água destilada no osso acima do OB. É importante manter esta área do osso úmido durante todo o experimento.
2. Preparando a janela craniana
- Retire a esponja de gelatina e começar por delicadamente raspando o osso com n ° 10 lâmina de bisturi. Mantenha um ângulo constante de 45 ° entre a lâmina eo osso, e mova a lâmina do pálpebras para o lado sagital da área do bulbo. Não aplique pressão vertical sobre o osso ou arranhar o osso acima do seio venoso.
- Durante o processo de desbaste, parar a cada 5min e coloque uma esponja de gelatina hidratada no osso para esfriar a preparação. Swab do crânio com a esponja para remover o pó de osso.
- Manter varrição erefrigeração alternadamente até visualizar as trabéculas, a camada de osso esponjoso. A vasculatura fina do OB deve ser visível nesta fase. Parar de coçar o osso, e começar a usar a ponta do bisturi de forma perpendicular para "desenhar" uma área retangular que envolve o OB. Nesta fase n ° 11 lâmina de bisturi pode ser usado. Mantenha a cirurgia dentro dos limites dos seios venosos que deve ser segura de qualquer curso bisturi.
- Dig gradualmente a vala formada retangular usando movimentos sucessivos do bisturi. Limpe a ponta do bisturi periodicamente para limpá-lo e mantê-la afiada. Ser mais cautelosos da profundidade da ponta para evitar tocar na superfície dura.
- A fim de obter uma idéia da espessura do osso remanescente, empurre-o suavemente com a ponta de um par de fórceps. Se as dobras retalho ósseo sob pressão, passar para a próxima etapa.
- De acordo com uma gota de solução salina, use a ponta do bisturi orientados horizontalmente para levantar o retalho ósseo. A remoção do retalho tem que ser feito carefully para evitar arrancando o osso remanescente.
- Uma vez que a superfície da OB é exposta, verificar a ausência de qualquer hemorragia ou anastomose dos vasos sanguíneos. Ferindo a dura ou a superfície do tecido irá reduzir as chances de obtenção de sinais ópticos. Limpe a área com uma esponja de gelatina embebida em solução salina, a fim de manter a umidade do bulbo.
- Aplicar cimento dental poliacrilato para formar um bem sobre o osso ao redor da janela.
- Coloque uma gota de baixo ponto de fusão de agarose (1,2%) sobre a dura-máter, e colocar uma tampa de vidro estéreis as dimensões da janela. Durante a sessão de imagens, uma pequena quantidade de agarose podem ser adicionados a fim de compensar a desidratação. Agarose impedirá que o OB do movimento com a respiração e irá proporcionar uma superfície plana para imagem óptica.
3. Configuração de imagem óptica para o mapeamento de atividade olfativa
- A estimulação olfativa deve ser definido com precisão no tempo e intensidade do uso de um olfatômetro. Usamos uma versão personalizada modificada do sistema de perfusão multivial Valvebank 8II de Automatize Científica associada a um compressor de ar básico (ar comprimido respirável seria adequado também). Este sistema permite o controle preciso da válvula, e rápido externo. Soluções de odores puros são diluídos em óleo mineral na concentração escolhida. Para ativar os aldeídos dorsal OB, como hexanal são comumente usados. Um volume preciso da odorant diluída (20 a 50μl) é carregado em um filtro de papel e colocados em um reservatório da seringa. Através do sistema de perfusão, pressão de ar controlada é entregue ao sistema, garantindo uma taxa constante de odorizado entrega fluxo de ar para o nariz de animais durante a abertura da válvula. Odorante é entregue através de uma tubulação de Tygon R-3603 de vácuo (Saint-Gobain Corporation) transportando ar a uma taxa de fluxo de ~ 1000ml/min. Evitar a contaminação entre odores e quantidades residuais de odores na tubulação. Se disponível, a reprodutibilidade do estímulo odorante pode ser controlled através do uso de um detector de ionização de chama (microFID Photovac 2020).
- A configuração óptica está ligado. Ele consiste de um resfriado entrelaçado 12 bits câmera CCD (ORCA AG Hamamatsu) associado com um estereomicroscópio de fluorescência (Leica MZ16), um olfatômetro controlado por computador e lâmpadas de excitação estabilizado com filtros de interferência apropriado bandpass. Um esquema que descreve a nossa configuração é fornecido na figura 2. Intrínseca para sinais ópticos Imaging (IOSI), uma lâmpada halógena de 200W de tungstênio (QTH Oriel) acoplado com uma luz anel de fibra (Schott) conectado em torno da objetiva do microscópio são usados para fornecer iluminação estável e uniforme. Para flavoproteína autofluorescência Sinais Imaging (FASI), uma lâmpada de 150W de metal Halide (Leica), com uma guia de luz 5 milímetros núcleo líquido fornecer mesmo excitação localizada da fluorescência através da porta de epi-iluminação do estereomicroscópio.
Aquisição de imagens e sincronização de hardware são realizados por software personalizado. A s abertasource micromanager software também pode ser usado para controlar a configuração óptica e aquisição.
4. Imagem óptica
- Coloque o quadro estereotáxico sob o estereomicroscópio, a janela craniana centrado no campo de visão (ver fig. 2A para um esquema da configuração óptica).
- Sintonize o microscópio para se concentrar nos capilares. Antes de ensaios estímulo (ver descrição em 5) uma imagem da lâmpada é tomada sob a luz 560nm (verde) (anel de fibra), que fornece um bom contraste para imagens de vasos sanguíneos. Esta imagem é usado como um controle anatômica para verificar o estado da preparação e é adquirido várias vezes durante o experimento.
- Para IOS imagem, refletida intensidade da luz é gravado pela câmera CCD em 630 + / -10 nm (vermelho) de iluminação. As imagens são adquiridas em full frame (sem binning) a 5 quadros por segundo que correspondem a um tempo de exposição de cerca de 150ms. Potência da fonte de luz é ajustado para re níveis ach cinza de pelo menos ~ 3000 na área de OB, perto da saturação dos pixels CCD poços. Se o fizer, torna possível para aproveitar a dinâmica 12bits do CCD para capturar alterações de intensidade leve durante a ativação. IOS máximo amplitudes chegar ~ 1%.
- FAS para imagens de fluorescência é adquirido sob excitação de 480nm + /-20nm de luz (azul) epiflurorescence. Um filtro passa-alta em 515nm é configurado para capturar a luz. As imagens são adquiridas em 5 quadros por segundo com um binning de 4 por 4 a maximizar a sensibilidade. Poder de luz de excitação é ajustada de forma semelhante ao IOS com níveis de cinza de 3000 na área de OB. Máxima FAS amplitudes chegar ~ 3%.
Para ambas as modalidades de imagem, a profundidade de campo no plano do assunto é o mesmo e foi medido em 0,5 mm para uma ampliação de cerca de 4 vezes.
- Luz devem ser desligados entre ensaios imagem para evitar aquecimento e fotodegradação da preparação.
- Sessão de imagem padrão incluía uma base de 5 a 10s onde o ar só é entregue, seguido pela estimulação odor por 3 a 10s, dependendo da concentração odor escolhido, e 70 a 82s são ainda gravado com um fluxo de ar constante para a recuperação de base (Fig. 2A). No final do julgamento, a luz é desligada e ar puro é entregue durante o período inter julgamento intervalo (1-3 minutos) para lavar as moléculas de odor residual e evitar a habituação sensorial. Odor ensaios foram intercaladas com ensaios em branco (entrega de ar).
- Odor-evoked zonas ativadas são visualizadas como áreas aproximadamente esférica nos mapas e correspondem ao tamanho dos glomérulos individuais (80 a 200μm de diâmetro 9). Processamento de imagens é explicada na Figura 2B. Mapas olfactivos são apresentados na Figura 3. Ao contrário do que qualquer outro sistema sensorial, a relação sinal-ruído na OB foi suficiente para resolver odor evocadas respostas em testes simples (Fig. 3B para IOS e Figo. 3D para FAS).
- Os ratos são sacrificados imediatamente no final da sessão de imagem usando métodos de acordo com recomendações europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório.
6. Resultados representante (ver mapas olfactivos na figura 3):
Figura 1 Organização estrutural do bulbo olfatório em roedores. Neurônios sensoriais olfativos primários, células sensoriais localizadas no epitélio olfatório, expressam o receptor de odorante mesmo e convergem para a mesma glomérulos no OB. Glomérulos olfativos, o neuropils de forma arredondada (círculos tracejada), estão localizados na superfície do OB. Note-se que uma rede muito densa e complexa vascular está presente ao nível glomerular. Abreviações (em cima / para baixo): ONL: camada nervo olfatório; GL: camada glomerular, EPL: camada plexiforme externa; MCL:camada de células mitral; GCL: camada de células granulares.
Figura Reflectância 2 e gravação de sinais de fluorescência in vivo. A. Wide-field configuração de imagem óptica. O cérebro de um rato anestesiado é exposto para vermelho (IOS) ou azul (FAS) de luz, quer através de um anel de fibra anular acoplado à lente óptica ou uma porta de epi-iluminação de um microscópio. Odores são carregadas em frascos lacrados e odorizado ar é entregue ao nariz animal (luz verde: válvula aberta). B. Gravação protocolo e processamento de dados. IOS e FAS são registrados como uma série de ensaios individuais (90 de duração). O diagrama mostra a timeline de um julgamento único: linha de base varia de 5 a 10s, a estimulação de 3 a 10s, e retornar ao valor basal de 70 a 82s. Processamento de imagem requer pixel por pixel de subtração de valores de intensidade durante a linha de base para valores de intensidade durante os períodos de estimulação (por FAS) or estimulação mais o retorno à linha de base (para IOS). Esta diferença é então dividido por valores de base para obter uma variação em% (ver imagens resultantes na fig. 3).
Figura 3 Odor evocadas mapas atividade no OB usando IOS e FAS imagem. A. Vascularização do OB dorsal visualizado sob luz verde. BC. IOS imaged (trial única versus média de três ensaios, respectivamente) para uma apresentação 10s de hexanal 20%. Setas brancas indicam as regiões de interesse esférica ativadas por esse odor. Estes mapas de ativação foram obtidos utilizando os quadros em média durante o primeiro segundo após o término da estimulação odor (máximo de reflectância variação -0,63% em A e -0,52% em B). Nota as zonas negras de absorbância onde a ativação odor ocorreu. CD. FAS adquiridos seqüencialmente no mesmo mouse para o mesmo odor (trial única versus média de três ensaios respectivosly). Estes mapas de ativação foram obtidos utilizando os quadros em média durante o primeiro segundo após o início da estimulação odor (máximo de fluorescência variação 0,72% na D e 0,66% em E). Note-se que as zonas brancas de emissão de autofluorescência indicado por setas pretas correspondem às zonas negras no IOS. O aspecto granulado visto no mapa FAS é devido ao 4 por 4 binning necessários para a melhoria da sensibilidade. FAS imagens não foram corrigidos de autofluorescência de branqueamento. Dimensões reais de imagens BE: 0,7 mm de largura x 1,2 mm de comprimento.
Discussion
Neste artigo apresentamos técnicas IOS e de imagem para FAS nas gravações vivo de odor evocadas atividades no OB mouse. Para atingir este objetivo relativamente simples e acessível de campo amplo de configuração de imageamento óptico é necessário. A aquisição de imagens de dados requer treinamento para realizar os procedimentos cirúrgicos bem e evitar qualquer prejuízo para a dura-máter ou tecido cerebral. Em particular, hemorragia grave vai absorver fótons registrados para a imagem latente e acabar o experimento.
Um dos benefícios de IOS e imagem FAS é evitar a injeção de traçadores fluorescentes, que pode resultar em toxicidade celular ou efeitos colaterais indesejáveis. Eles fazem o possível para enfrentar as questões sobre mapas olfactivos, portanto, a codificação espacial de estímulos sensoriais. Ao contrário do que 2-Desoxiglucose imagem, eles fornecem a possibilidade de odores imagem várias em um único animal. No entanto, uma vez que a penetração fóton é limitada no tecido, IOS e FAS são restritas à parte dorsal da OBe não pode ser gravado a partir de regiões ventral.
Imagem do sinal óptico endógena oferece excelente resolução espacial na imagem in vivo. Técnico cálculos melhorias preocupação quantitativa de componentes vasculares na reflectância sinais 8,9, bem como a dinâmica de oxigenação do sangue e volume durante a ativação sensorial 10. Imagem Múltiplos Comprimentos de Onda de abordagens IOS imagem são actualmente desenvolvidos em nosso laboratório para quantificar completamente a concentração de hemoglobina total e oxigenação no OB durante a ativação sensorial. Estas medições espectroscópicas ópticas adicionado ao FAS imagem dará a oportunidade de responder a relação não resolvida entre a dinâmica vascular e intracelular durante a ativação sensorial 11,12.
Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela "Agence Nationale de la Recherche" conceder ANR-09-JCJC-0117-01 e "Neuropôle de Recherche Francilien-NERF" subvenção para Romain Chery. Agradecemos a Françoise Lefebvre para o desenvolvimento de software em C + + / Qt, e Laurent e Pinot Batiste Janvier para ajudar no desenvolvimento da configuração da imagem óptica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imalgene | Merial | ||
| Rompun | Bayer AG | ||
| Agarose, type III-A | Sigma-Aldrich | A9793-50G | |
| Hexanal 98% | Aldrich | 115606-100ML |
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