Summary
Denne artikel præsenterer protokollerne for iboende optiske signaler og flavoproteins autofluorescens signaler billeddannelse til at kortlægge lugt-evoked aktiviteter på overfladen af lugtekolben hos mus.
Abstract
I hjernen, aktiverer sensorisk stimulation fordelt populationer af neuroner blandt funktionelle moduler, der deltager i kodningen af stimulus. Funktionelle optiske billeddannende teknikker er fordelagtigt at visualisere aktiveringen af disse moduler i sensorisk cortex med høj rumlig opløsning. I denne sammenhæng er endogene optiske signaler, der opstår fra molekylære mekanismer, der er knyttet til neuroenergetics værdifulde kilder til kontrast til at registrere rumlige kort over sensoriske stimuli i store felter i gnavere hjernen.
Her præsenterer vi to teknikker baseret på ændringer af endogene optiske egenskaber af hjernevæv under aktivering. Først iboende optiske signaler (IOS) er fremstillet af en lokal ændring i rødt lysreflektion skyldes: (i) overvæltning af ændringer i blodets iltning niveau og blodvolumen (ii) photon spredning. Anvendelsen af in vivo IOS at indspille rumlige kort startede i midten af 1980'erne med observatiom af optiske kort over knurhår tønder i rotter og orientering kolonnerne i katten visuelle cortex 1. IOS billeder af overfladen af den gnaver vigtigste lugtekolben (OB) som svar på lugtstoffer blev senere påvist ved Larry Katz gruppe 2. Den anden tilgang er baseret på flavoprotein autofluorescens signaler (FAS) på grund af ændringer i redox tilstand af disse mitokondrie metaboliske mellemprodukter. Mere præcist, er den teknik, baseret på den grønne fluorescens skyldes oxiderede tilstand flavoproteins når vævet er begejstret med blåt lys. Selv om sådanne signaler blev formentlig blandt de første fluorescerende molekyler er registreret for studiet af hjernens aktivitet ved pioner studier af Britton Chancer og kolleger 3, var det ikke før for nylig, at de har været brugt til kortlægning af hjernens aktivering in vivo. FAS billeddannelse blev første gang anvendt på somatosensoriske cortex hos gnavere som reaktion på hindpaw stimulation af Katsuei Shibuki gruppe 4.
Den olfaktoriske system er af central betydning for overlevelsen af det store flertal af levende arter, fordi det giver mulighed for effektiv sporing og identifikation af kemiske stoffer i miljøet (mad, rovdyr). I OB er det første relæ af olfaktoriske informationsbehandling i hjernen. Den modtager afferente fremskrivninger fra olfaktoriske primære sensoriske neuroner, der registrerer flygtige lugtstof molekyler. Hver sensoriske neuron udtrykker kun én type af lugtstof receptor og neuroner bærer samme type receptor sender deres nerve-processer til det samme veldefinerede microregions af ~ 100μm 3 består af diskrete neuropil, det olfaktoriske glomeruli (fig. 1). I det sidste årti, har IOS imaging fremmet funktionelle udforskning af OB 5, 6, 7, som er blevet et af de mest undersøgte sensoriske strukturer. Kortlægningen af OB aktivitet med FAS billeddannelse er ikke udført endnu.
Her we viser de forskellige trin i en effektiv protokol for IOS og FAS billedbehandling til at kortlægge lugt-fremkaldte aktiviteter i musen OB.
Protocol
1. Klargøring af dyr for billedbehandling (i overensstemmelse med europæiske anbefalinger for pasning og anvendelse af forsøgsdyr, 86/609/EØF direktiv)
- 6 til 8 uger gammel C57BL6 hanmus bliver bedøvet med en cocktail af ketamin (10mg/kg) og xylazin (100mg/kg) injiceres intraperitonealy. Kirurgi begynder, når musen ikke længere reagerer på hindpaw knibe. Under hele forsøget dyret er placeret på en varmepude. Kropstemperatur er løbende overvåges og vedligeholdes ved 37 ° C. Anæstesidybden opretholdes under hele operationen og billedbehandling session ved at tjekke mangel af lemmer trække sig tilbage. En subkutan injektion af 20% af den oprindelige bedøvelse cocktail ellers administreres.
- Ved hjælp af klippere, skal du fjerne hår fra hovedbunden. Rens eksponeret hud fra resterende hår ved hjælp af steril gaze vædet med saltvand.
- Placer musen i stereotaxic rammen. Den snude er nødt til at være i samme plan som bagsiden af hovedet,for at sætte overfladen af lugtekolben til vandret. Sikker fast i øret og næsen barer for at forhindre bevægelser under billedbehandling.
- Anvend oftalmologiske salve på dyrets øjne for at forhindre udtørring og smerte.
- Desinficer alle kirurgiske instrumenter med 70 ° ethanol og hovedbunden område med successive fejer af betadine.
- For at fjerne hud kraniet, starter med at lave et snit i huden med en saks på bagsiden af hovedet mellem ørerne. Derefter skæres i begge sider mod bunden af øret og i den anteroposterior retning mod panden langs øjenlåg. Afslut fjernelse af hovedbunden ved at skære i huden oven på snuden tæt på næsen bar.
- Under kikkerten observation, kan du bruge en vatpind fugtet med saltvand til forsigtigt at afmontere periosteum på toppen af kraniet. Brug et par pincet til at fjerne de resterende væv og skrabe overfladen af kraniet med en skalpel for at have en ren forberedelse.
- I OB er en symmetrisk struktur, der består af to hemibulbs som er placeret mellem øjenlågene. De er begrænset i rostralt og i den caudale retning af en venøs sinus, og adskilt af sagittale sutur. Læg et stykke resorberbare gelatine svamp fugtet med destilleret vand på knoglen over OB. Det er vigtigt at holde denne knogle-området fugtigt gennem hele eksperimentet.
2. Forberedelse af kranie vinduet
- Fjern gelatine svamp og starter ved forsigtigt at skrabe knoglen med n ° 10 skalpelblad. Hold en konstant vinkel på 45 ° mellem bladet og ben, og flytte bladet fra øjenlågene til sagittal side af pæren området. Må ikke anvendes lodret pres på knoglen eller ridse knoglen over venøse sinus.
- Under udtynding proces, stop hver 5min og placere en hydreret gelatine svamp på knoglen for at køle ned præparatet. Swab kraniet med svamp til at fjerne knogle støv.
- Hold fejning ogkøling alternativt indtil visualisere Bjælkerne, den svampede knogle lag. Den fine vaskulaturen af OB skal være synlige på dette stadium. Stop skrabe knoglen, og begynde at bruge skalpel tip vinkelret til at "trække" et rektangulært område omslutter OB. På dette stadium nr. 11 skalpelblad kan bruges. Hold operationen inden for rammerne af de venøse sinus, der skal sikre enhver skalpel slagtilfælde.
- Dig efterhånden dannet rektangulære renden ved hjælp successive bevægelser af skalpel. Tør spidsen af skalpellen jævne mellemrum at rense det og holde det skarpe. Vær ekstra forsigtig med dybden af spidsen for at undgå at røre ved dura overfladen.
- For at få en fornemmelse af tykkelsen af de resterende ben, skub det forsigtigt med spidsen af et par pincet. Hvis knoglen flap foldes under pres, gå videre til næste trin.
- Under en dråbe af saltvand, skal du bruge spidsen af skalpellen orienteret vandret for at løfte knoglen flap. Fjernelsen af flap der skal gøres Carefully at undgå at rive de resterende ben.
- Når OB overflade er udsat for, kontrollere, om der ikke foreligger nogen blødning eller blodkar anastomose. Skade dura eller vævet overflade vil reducere chancerne for at opnå optiske signaler. Tør området med en gelatine svamp dyppet i saltvand for at holde pæren fugtig.
- Anvend polyacrylat dental cement til at danne en brønd på knoglen omkring vinduet.
- Placer en dråbe lavt smeltepunkt agarose (1,2%) i forhold til dura, og læg et sterilt dække glas på dimensionerne af vinduet. I løbet af imaging session, kan en lille mængde agarose blive tilføjet for at kompensere for udtørringen. Agarose vil forhindre OB i at bevæge sig med åndedræt og vil give en flad overflade til optiske billeddannelse.
3. Optisk billeddannelse opsætning for olfaktoriske aktivitet, kortlægning
- Den olfaktoriske stimulering skal være præcist defineret i tid og intensitet ved brug af en olfactometer. Vi bruger en brugerdefineret modificeret udgave af multivial perfusion systemet Valvebank 8II fra Automatiser Videnskabelige forbundet med en grundlæggende luft kompressor (komprimeret åndbar luft ville være velegnet såvel). Dette system giver mulighed for præcis og hurtig ekstern ventilstyring. Opløsninger af ren duftstof er fortyndet i mineralsk olie ved den valgte koncentration. For at aktivere ryggens OB aldehyder som hexanal er almindeligt anvendt. En præcis volumen af den fortyndede lugtstof (20 til 50μl) er lastet på et filtrerpapir og anbringes i en sprøjte reservoir. Gennem perfusion systemet, er trykstyret luft, der leveres til systemet, hvilket sikrer en konstant hastighed på odorized luft flux levering til dyret næse under ventilen åbning. Lugtstof er leveret gennem en Tygon R 3603 Vacuum slange (Saint-Gobain Corporation) at luften ved en flowhastighed på ~ 1000ml/min. Undgå kontaminering mellem duftstoffer og restmængder af lugtstof i slangen. Hvis det er tilgængeligt, kan reproducerbarheden af de odorant stimulus være kontroversiellled gennem brug af en flammeioniseringsdetektor (microFID 2020 Photovac).
- Den optiske setup er tændt. Den består af en kølet interlaced 12 bits CCD kamera (ORCA AG Hamamatsu) forbundet med en fluorescens stereomikroskop (Leica MZ16), en computer styret olfactometer og stabiliseret excitation lamper med passende bandpass interferens filtre. En ordning, der beskriver vores setup er givet i figur 2. For Intrinsic optiske signaler Imaging (IOSI), en 200W wolfram halogen lampe (Oriel QTH) kombineret med en fiber-ring lys (Schott) sat rundt om mikroskopet målet er vant til at give en stabil og ensartet belysning. For Flavoprotein autofluorescens Signaler Imaging (FASI), en 150W metalhalogen lampe (Leica) med en 5mm kerne flydende lysleder yde endnu lokaliseret excitation af fluorescens gennem epi-belysning havn i stereomikroskop.
Image Acquisition og hardware synkronisering er realiseret ved sædvane software. Den åbne source software Micromanager kan også bruges til at styre den optiske opsætning og erhvervelse.
4. Optisk billeddannelse
- Placer stereotaxic rammen under stereomikroskop, kranie vinduet centreret i synsfeltet (se fig. 2A for en skematisk af det optiske setup).
- Stil mikroskopet til at fokusere på kapillærerne. Forud for stimulation forsøg (se beskrivelse i 5) et billede af pære er truffet i henhold til 560nm (grøn) lys (fiber ring), der giver en god kontrast til blodkar billeddannelse. Dette billede bliver brugt som et anatomisk kontrol for at kontrollere status for forberedelse og erhverves flere gange under forsøget.
- For IOS billedbehandling, reflekteret lys intensitet er optaget med CCD-kamera under 630 + / -10 nm (rød) belysning. Billederne er erhvervet på full frame (ingen binning) ved 5 billeder i sekundet, der svarer til en eksponering på ca 150ms. Effekt af lyskilden er justeret til re ACH grå niveauer af mindst ~ 3000 på det OB-området, tæt på mætning af CCD pixels brønde. Gør det, gør det muligt at drage fordel af 12bits dynamikken i CCD at fange svage intensitet ændringer under aktivering. Maksimal IOS amplituder nå ~ 1%.
- For FAS billeddannelse fluorescens er erhvervet under excitation af 480nm + /-20nm (blå) epiflurorescence lys. Et high-pass filter ved 515nm er sat op til at fange lys. Billederne er erhvervet på 5 billeder i sekundet med en binning af 4 med 4 for at maksimere følsomhed. Excitation lys magt er justeret på samme måde som IOS med grå niveauer i 3000 på det OB-området. Maksimal FAS amplituder nå ~ 3%.
For begge billeddiagnostiske metoder, er dybdeskarpheden i faget flyet den samme, og blev målt til 0,5 mm for en forstørrelse på omkring 4 gange.
- Lyset skal være slukket mellem billeddiagnostiske undersøgelser for at undgå opvarmning og fotoblegning af præparatet.
- Standard billeddannelse session inkluderede en baseline på 5 til 10s, hvor der kun luft er leveret, efterfulgt af lugt stimulering i 3 til 10 sekunder, afhængigt af den valgte lugt koncentration, og 70 til 82s er yderligere indspillet med en konstant luftstrøm til baseline genopretning (Fig. 2A). Ved afslutningen af forsøget, er lys slukket og ren luft er leveret til den inter retssagen interval varighed (1 til 3 minutter) for at udvaske resterende lugtmolekyler og undgå sensoriske tilvænning. Lugt forsøg blev interleaved med tomme forsøg (luft levering).
- Lugt-evoked aktiverede zoner er visualiseret som nogenlunde sfærisk områder på kortene og svarer til størrelsen af de enkelte glomeruli (80 til 200μm i diameter 9). Billedbehandling er forklaret i figur 2B. Olfaktoriske kort er præsenteret i Figur 3. I modsætning til andre sensoriske system, signal-støj-forholdet i OB var tilstrækkelig til at løse lugt-fremkaldt reaktioner i enkelt forsøg (Fig. 3B til IOS og Fig. 3D for FAS).
- Mus er aflives straks ved afslutningen af den billeddiagnostiske session ved hjælp af metoder i overensstemmelse med europæiske anbefalinger for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
6. Repræsentative resultater (se olfaktoriske kort i figur 3):
Figur 1 strukturelle opbygning af de vigtigste lugtekolben hos gnavere. Olfaktoriske sensoriske neuroner, primære sensoriske celler beliggende i de vigtigste lugtepithelet, udtrykker samme lugtstof receptor og konvergere på samme glomeruli i OB. Olfaktoriske glomeruli, den runde-formede neuropils (stiplede cirkler), er placeret på overfladen af OB. Bemærk, at en meget tætte og komplekse vaskulære netværk er til stede på den glomerulære niveau. Forkortelser (top / ned): Onlinekanaler: lugtenerven lag; GL: glomerulær lag, EPL: eksterne plexiform lag; MCL:mitral cellelag; GCL: granula cellelag.
Figur 2 Reflektans og fluorescens signaler optagelse in vivo. A. Wide-field optisk billeddannelse setup. Hjernen på en bedøvet mus er udsat for enten rød (IOS) eller blå (FAS) lys enten gennem en ringformet fiber ring fastgjort til optik linse eller en epi-belysning havn i et mikroskop. Lugte er indlæst i forseglede hætteglas og odorized luft leveres til dyret næsen (grønt lys: åben ventil). B. Optagelse protokol og databehandling. IOS og FAS registreres som række individuelle studier (90'erne af varighed). Diagrammet viser tidslinjen i et enkelt forsøg: baseline varierer fra 5 til 10s, stimulation fra 3 til 10'ere, og vende tilbage til baseline fra 70 til 82s. Billedbehandling kræver pixel-for-pixel subtraktion af intensitet værdier under baseline til intensiteten værdier i perioder med stimulation (for FAS) or stimulation plus vende tilbage til baseline (for IOS). Denne forskel er derefter divideret med baseline værdier for at opnå en variation i% (se resulterende billeder i Fig. 3).
Figur 3 Lugt-evoked aktivitet kort i OB bruger IOS og FAS billeddannelse. A. vaskulaturen af den dorsale OB visualiseret under grønt lys. BC. IOS filmede (enkelt forsøg versus tre gennemsnit forsøg henholdsvis) for en 10s præsentation af 20% hexanal. Hvide pile angiver sfæriske regioner af interesse aktiveres af denne lugt. Disse aktivering kort blev opnået ved brug af frames i gennemsnit i løbet af det første sekund efter afslutningen af lugt stimulation (maks. reflektans variation -0,63% i A og -0,52% i B). Bemærk den sorte zoner af absorbans, hvor lugt aktiveringen har fundet sted. CD. FAS erhvervet sekventielt i samme mus til samme odorant (enkelt forsøg versus tre gennemsnit forsøg respektively). Disse aktivering kort blev opnået ved brug af frames i gennemsnit i løbet af det første sekund efter begyndelsen af lugt stimulation (maks. fluorescens variation 0,72% i D og 0,66% i E). Bemærk, at den hvide zoner autofluorescens emission angivet med sorte pile svarer til de sorte områder i IOS. De grynede aspekt ses i FAS kortet skyldes de 4 af 4 binning kræves for at forbedre følsomheden. FAS billeder blev ikke korrigeret fra autofluorescens blegning. Faktisk dimensioner af billeder: 0,7 mm bred x 1,2 mm lang.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi IOS og FAS billeddannende teknikker til in vivo-optagelser af lugt-evoked aktiviteter i musen OB. For at nå dette mål en relativt enkel og billig bredt felt optiske billeddannelse opsætning er nødvendig. Købet af billeddata kræver uddannelse til at udføre de fine kirurgiske procedurer og undgå skader på dura eller hjernevæv. Navnlig vil større blødning absorbere fotoner registreres for billedbehandling og ender eksperimentet.
En fordel ved IOS og FAS billeddannelse er at undgå injektion af fluorescerende sporstoffer, som kan resultere i cellulær toksicitet eller uønskede bivirkninger. De gør det muligt at håndtere spørgsmål om olfaktoriske kort dermed rumlig kodning af sensoriske stimuli. I modsætning til 2-DeoxyGlucose billeddannelse, de giver mulighed for at billede flere lugte i et enkelt dyr. Men da foton penetration er begrænset i vævet, er IOS og FAS begrænset til den dorsale del af OBog kan ikke optages fra ventrale regioner.
Endogen optiske signal billeddannelse tilbyder fremragende rumlig opløsning til in vivo billeddannelse. Tekniske forbedringer bekymring kvantitative beregninger af vaskulære komponenter i reflektans signaler 8,9 samt dynamikken i blodets iltning og lydstyrken under sensorisk aktivering 10. Multiwavelength billeddannelse af IOS billeddiagnostiske metoder er i øjeblikket udvikles i vores laboratorium til fuldt ud at kvantificere total hæmoglobin koncentration og iltning i OB under sensoriske aktivering. Disse spektroskopiske optiske målinger tilføjet til FAS billeddannelse vil give mulighed for at besvare det uløste forholdet mellem vaskulære og intracellulær dynamik under sensorisk aktivering 11,12.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af "Agence Nationale de la Recherche" grant ANR-09-JCJC-0117-01 og "Neuropôle de Recherche Francilien-NERF" tilskud til Romain Chery. Vi takker Françoise Lefebvre for softwareudvikling i C + + / Qt, og Laurent Pinot og Batiste Janvier om hjælp i udviklingen af den optiske billeddannelse setup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imalgene | Merial | ||
| Rompun | Bayer AG | ||
| Agarose, type III-A | Sigma-Aldrich | A9793-50G | |
| Hexanal 98% | Aldrich | 115606-100ML |
References
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Rubin, B. D., Katz, L. C. Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb. Neuron. 23, 499-511 (1999).
- Chance, B., Cohen, P., J&246, bsis, &, F., Schoener, B.
- Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence. J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).
- Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake. Neuron. 52, 335-345 (2006).
- Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb. Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).
- Meister, M., Bonhoeffer, T. Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).
- Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation. Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).
- L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations. Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).
- Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper). Photonics West Conference, , (2011).
