Summary
Cet article présente les protocoles d'intrinsèques des signaux optiques et d'imagerie d'autofluorescence flavoprotéines signaux de cartographier les odeurs évoquées activités à la surface du bulbe olfactif chez la souris.
Abstract
Dans le cerveau, la stimulation sensorielle active des populations de neurones distribués parmi les modules fonctionnels qui participent à la codification du stimulus. Fonctionnelle des techniques d'imagerie optique sont avantageux pour visualiser l'activation de ces modules dans cortex sensoriels à haute résolution spatiale. Dans ce contexte, endogènes signaux optiques qui découlent de mécanismes moléculaires liés à neuroénergétique sont de précieuses sources de contraste d'enregistrer des cartes spatiales des stimuli sensoriels plus larges champs dans le cerveau des rongeurs.
Ici, nous présentons deux techniques basées sur les variations des propriétés optiques endogènes du tissu du cerveau pendant l'activation. D'abord les signaux optiques intrinsèques (IOS) sont produites par une altération locale de réflexion de la lumière rouge en raison de: (i) l'absorption par les changements de niveau d'oxygénation du sang et du volume sanguin (ii) la diffusion des photons. L'utilisation in vivo des IOS pour enregistrer des cartes spatiales a commencé dans le milieu des années 1980 avec les observatisur des cartes optiques de barils moustaches chez le rat et les colonnes d'orientation dans le cortex visuel de chat 1. IOS imagerie de la surface du rongeur bulbe olfactif principal (OB) en réponse à plus tard a été démontré odorants par groupe de Larry Katz 2. La seconde approche repose sur les signaux d'autofluorescence flavoprotéine (FAS) en raison de changements dans l'état redox de ces intermédiaires métaboliques mitochondriales. Plus précisément, la technique est basée sur la fluorescence verte due à l'état oxydé du flavoprotéines lorsque le tissu est excité par la lumière bleue. Bien que ces signaux ont probablement été parmi les premières molécules fluorescentes enregistré pour l'étude de l'activité du cerveau par les études pionnières des Chances Britton et ses collègues 3, il n'a pas été jusqu'à récemment qu'elles ont été utilisées pour la cartographie de l'activation du cerveau in vivo. SAF imagerie a été d'abord appliquée au cortex somatosensoriel chez les rongeurs en réponse à une stimulation patte postérieure par groupe Katsuei Shibuki 4.
Le système olfactif est d'une importance capitale pour la survie de la grande majorité des espèces vivantes car il permet une détection efficace et d'identification des substances chimiques dans l'environnement (nourriture, des prédateurs). L'OB est le premier relais de traitement de l'information olfactive dans le cerveau. Il reçoit des projections afférentes du olfactifs primaires neurones sensoriels qui permettent de détecter des molécules volatiles odorantes. Chaque neurone sensoriel exprime un seul type de récepteur odorant et les neurones portant le même type de récepteur envoient leurs prolongements nerveux à la même bien définis microrégions de ~ 100 microns 3 constitué de neuropile discret, le glomérule olfactif (fig. 1). Dans la dernière décennie, IOS d'imagerie a favorisé l'exploration fonctionnelle de l'OB 5, 6, 7, qui est devenu l'une des structures les plus étudiées sensorielle. La cartographie de l'activité d'imagerie OB avec le SAF n'a pas été réalisée ce jour.
Ici, we montrent les étapes successives d'un protocole efficace pour les IOS et le SAF imagerie pour cartographier les odeurs évoquées activités dans l'OB de la souris.
Protocol
1. Préparer l'animal pour l'imagerie (en conformité avec les recommandations européennes pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire, la directive 86/609/CEE)
- 6 à 8 semaines vieilles souris mâles C57BL6 sont anesthésiés avec un cocktail de kétamine (10mg/kg) et de xylazine (100mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Chirurgie commence lorsque la souris ne répond plus aux pattes arrière de pincement. Pendant toute l'expérience de l'animal est placé sur un coussin chauffant. La température du corps est constamment surveillée et maintenue à 37 ° C. Profondeur de l'anesthésie est maintenue pendant toute la chirurgie et la session d'imagerie en vérifiant l'absence d'un membre retirer. Une injection sous-cutanée de 20% du cocktail initiales anesthésique est administré autrement.
- En utilisant tondeuses, enlever les poils du cuir chevelu. Nettoyer la peau exposée à partir de cheveux résiduelles en utilisant une gaze stérile imbibée de sérum physiologique.
- Placez la souris dans le cadre stéréotaxique. Le museau doit être dans le même plan que le dos de la tête,afin de définir la surface du bulbe olfactif à l'horizontale. Fixez solidement l'oreille et le nez bars afin d'empêcher les mouvements pendant l'imagerie.
- Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal pour éviter le dessèchement et la douleur.
- Désinfecter tous les instruments chirurgicaux avec l'éthanol 70 ° et la zone du cuir chevelu avec des balayages successifs du bétadine.
- Pour enlever la peau qui recouvre le crâne, commencez par faire une incision dans la peau avec des ciseaux à l'arrière de la tête entre les oreilles. Ensuite, couper dans les deux côtés vers la base de l'oreille et dans le sens antéropostérieur vers le front le long de la paupière. Terminer enlever le cuir chevelu en coupant la peau sur le dessus du museau à proximité de la barre de nez.
- Sous observation binoculaire, utilisez un coton-tige imbibé de sérum physiologique pour détachez le périoste sur le sommet du crâne. Utilisez une pince pour enlever le tissu restant et racler la surface du crâne avec un scalpel pour avoir une préparation propre.
- L'OB est une structure symétrique composé de deux hemibulbs qui sont situés entre les paupières. Elles sont limitées dans la rostrale et dans la direction caudale par un sinus veineux, et séparés par la suture sagittale. Placez un morceau d'éponge imbibée de gélatine absorbable eau distillée sur l'os au-dessus de l'OB. Il est important de garder cette zone de l'os humide toute l'expérience.
2. Préparer la fenêtre crânienne
- Retirez l'éponge de gélatine et de commencer en grattant doucement l'os avec le n ° 10 lame de bistouri. Gardez un angle constant de 45 ° entre la lame et l'os, et déplacer la lame de la paupière vers le côté sagittale de la zone de l'ampoule. Ne pas appliquer une pression verticale sur l'os ou de gratter l'os au-dessus du sinus veineux.
- Pendant le processus d'amincissement, arrêter tous les 5min et le lieu d'une éponge de gélatine hydratée sur l'os pour refroidir la préparation. Swab le crâne avec l'éponge pour enlever la poussière d'os.
- Gardez le balayage etde refroidissement bien jusqu'à la visualisation des travées, la couche d'os spongieux. La vascularisation fine de l'OB doit être visible à ce stade. Arrêtez gratter l'os, et commencer à utiliser la pointe du bistouri perpendiculairement à "dessiner" une zone rectangulaire entourant l'OB. A ce stade, n ° 11 lame de bistouri peut être utilisé. Gardez la chirurgie dans les limites des sinus veineux qui doit être sûre de tout coup de scalpel.
- Creusez la tranchée progressivement formé rectangulaires en utilisant mouvements successifs du scalpel. Essuyer l'embout du scalpel périodiquement pour le nettoyer et de le garder coupants. Soyez très prudent de la profondeur de la pointe pour éviter de toucher la surface dure-mère.
- Afin d'obtenir un sens de l'épaisseur de l'os restant, poussez-le délicatement avec la pointe d'une paire de pinces. Si les plis volet osseux sous pression, passer à l'étape suivante.
- En vertu d'une goutte de solution saline, utilisez la pointe de l'orientées horizontalement pour bistouri soulever le volet osseux. La suppression de la trappe qui doit être fait carefully pour éviter de déchirer l'os restant.
- Une fois la surface de l'OB est exposée, de vérifier l'absence de tout saignement ou les vaisseaux sanguins anastomose. Blesser les-mère ou la surface du tissu permettra de réduire les chances d'obtenir des signaux optiques. Essuyez la zone avec une éponge de gélatine trempées dans une solution saline, afin de conserver l'humidité ampoule.
- Appliquer polyacrylate ciment dentaire pour former un puits sur l'os autour de la fenêtre.
- Déposer une goutte de bas point de fusion d'agarose (1,2%) au cours de la dure-mère, et mettre un couvercle en verre stérile à la dimension de la fenêtre. Lors de la séance d'imagerie, une petite quantité d'agarose peuvent être ajoutées afin de compenser le dessèchement. Agarose permettra d'éviter l'OB de se déplacer avec la respiration et offrira une surface plane pour l'imagerie optique.
3. L'imagerie optique de configuration pour la cartographie de l'activité olfactive
- La stimulation olfactive doit être précisément définie dans le temps et l'intensité de l'utilisation d'un olfactomètre. Nous utilisons une version modifiée de coutume MultiVial perfusion du système Valvebank 8II d'automatiser scientifique associée à une base compresseur d'air (air comprimé respirable serait adapté aussi bien). Ce système permet un contrôle précis et rapide de soupape externe. Les solutions de pures odorantes sont diluées dans une huile minérale à la concentration choisie. Pour activer les aldéhydes dorsale OB tels que l'hexanal sont couramment utilisés. Un volume précis de l'odorant dilué (20 à 50 pl) est chargé sur un papier filtre et placés dans un réservoir seringue. Grâce au système de perfusion, la pression atmosphérique contrôlé est livré pour le système, assurant un taux constant de livraison odorisé flux d'air dans le nez des animaux lors de l'ouverture de la vanne. Odorant est livrée à travers un tube Tygon R-3603 Vacuum (Saint-Gobain Corporation) portant l'air à un débit de ~ 1000ml/min. Éviter la contamination entre les molécules odorantes et les quantités résiduelles de odorisant dans le tube. Si disponible, la reproductibilité de la stimulation odorante peut être controlled par l'utilisation d'un détecteur à ionisation de flamme (2020 microFID Photovac).
- La configuration optique est allumée. Il se compose d'un refroidissement entrelacé 12 bits caméra CCD (ORCA AG Hamamatsu) associé à un stéréomicroscope à fluorescence (Leica MZ16), un olfactomètre contrôlé par ordinateur et des lampes d'excitation appropriée stabilisé avec des filtres d'interférence bande passante. Un schéma décrivant notre configuration est fournie dans la figure 2. Pour intrinsèque signaux d'imagerie optique (IOSI), une lampe au tungstène 200W halogène (QTH Oriel) couplé à un anneau de fibre légère (Schott) branchée sur l'objectif du microscope sont utilisés pour fournir un éclairage stable et homogène. Pour flavoprotéine Signaux Autofluorescence Imaging (FASI), une lampe aux halogénures métalliques 150W (Leica) avec un guide de lumière noyau liquide 5mm fournir même une excitation localisée de la fluorescence par le port épi-illumination du stéréomicroscope.
L'acquisition des images et la synchronisation du matériel sont réalisés par un logiciel personnalisé. Le s ouvrirOurce logiciels microgestionnaire peut également être utilisé pour contrôler la configuration optique et d'acquisition.
4. L'imagerie optique
- Placez le cadre stéréotaxique sous la loupe binoculaire, la fenêtre crânienne centré dans le champ de vue (voir Fig. 2A pour un schéma du montage optique).
- Tune au microscope pour se concentrer sur les capillaires. Avant les essais de stimulation (voir description en 5) une image de l'ampoule est prise en vertu de 560nm (vert) (anneau de fibre) qui fournit un bon contraste pour l'imagerie des vaisseaux sanguins. Cette image est utilisée comme un contrôle anatomique de vérifier l'état de la préparation et est acquis à plusieurs reprises pendant l'expérience.
- Pour IOS imagerie, reflète l'intensité lumineuse est enregistrée par la caméra CCD en 630 + / -10 nm (rouge) d'illumination. Les images sont acquises à l'image complète (pas de binning) à 5 images par seconde qui correspond à un temps d'exposition d'environ 150ms. Puissance de la source lumineuse est ajustée à nouveau haque niveaux de gris d'au moins ~ 3000 sur la zone OB, proche de la saturation des puits CCD pixels. Cela permet de profiter de la dynamique du CCD 12bits pour saisir les changements d'intensité légère pendant l'activation. Maximum amplitudes IOS atteindre ~ 1%.
- Pour le SAF imagerie de fluorescence est acquis en vertu d'excitation de 480nm + /-20nm (bleu) de lumière epiflurorescence. Un filtre passe-haut à 515nm est mis en place pour capter la lumière. Les images sont acquises à 5 images par seconde avec un binning de 4 par 4 pour maximiser la sensibilité. Puissance lumineuse d'excitation est ajusté similaire à IOS avec des niveaux de gris de 3000 sur la zone OB. Maximum amplitudes SAF atteindre ~ 3%.
Pour les deux modalités d'imagerie, la profondeur de champ dans le plan du sujet est le même et a été mesurée à 0,5 mm pour un grossissement d'environ 4 fois.
- La lumière doit être éteinte entre les essais d'imagerie afin d'éviter le chauffage et photoblanchiment de la préparation.
- Norme session d'imagerie comprenait une base de 5 à 10s où l'air est livrée seule, suivie par la stimulation des odeurs pour 3 à 10s selon la concentration d'odeur choisi, et de 70 à 82S sont encore enregistrés avec un débit d'air constant pour la récupération de base (fig. 2A). A la fin du procès, la lumière est éteinte et l'air pur est livré pour la durée de l'intervalle entre essais (1 à 3 minutes) pour laver les molécules d'odeur résiduelle et éviter l'accoutumance sensorielle. Essais d'odeurs ont été intercalées avec des essais en blanc (livraison par avion).
- Odeur évoqués zones activées sont visualisés comme des zones grossièrement sphérique sur les cartes et correspondent à la taille de l'individu glomérules (80 à 200μm de diamètre 9). Traitement de l'image est expliqué dans la figure 2B. Cartes olfactives sont présentés dans la figure 3. Contrairement à tout autre système sensoriel, le rapport signal-bruit dans l'OB a été suffisant pour résoudre les odeurs réponses évoquées dans les essais simples (Fig. 3B pour IOS et Fig. 3D pour le SAF).
- Les souris sont euthanasiés immédiatement à la fin de la séance d'imagerie utilisant des méthodes conformes aux recommandations européennes pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
6. Les résultats représentatifs (voir les cartes olfactives dans la figure 3):
Figure 1 organisation structurelle de l'ampoule olfactif principal chez les rongeurs. Neurones sensoriels olfactifs, des cellules primaires sensoriels situés dans l'épithélium olfactif principal, expriment le récepteur odorant mêmes et convergent sur le même glomérule dans l'OB. Glomérules olfactifs, les neuropils de forme ronde (cercles pointillés), sont situés à la surface de l'OB. Notez que d'un réseau très dense et complexe vasculaire est présente au niveau glomérulaire. Abréviations (haut / bas): ONL: Couche nerf olfactif; GL: couche glomérulaire, la LPE: couche externe plexiforme; MCL:couche de cellules mitrales; GCL: couche de cellules granulaires.
Figure 2 réflectance et l'enregistrement des signaux de fluorescence in vivo. A. grand champ de configuration d'imagerie optique. Le cerveau d'une souris anesthésiée est exposé à deux rouges (IOS) ou bleu (SAF) soit la lumière à travers un anneau de fibre annulaire fixé à l'objectif optique ou d'un port épi-illumination d'un microscope. Les odeurs sont chargés dans des flacons scellés et odorisé l'air est livré au nez des animaux (vert clair: ouvrir la vanne). B. Enregistrement du protocole et de traitement des données. IOS et le SAF sont enregistrées sous forme de séries d'essais individuels (d'une durée de 90s). Le diagramme montre le scénario d'un seul essai: de base varie de 5 à 10s, la stimulation de 3 à 10s, et le retour à la normale de 70 à 82S. Traitement de l'image nécessite pixel par pixel soustraction des valeurs d'intensité durant la référence pour les valeurs d'intensité pendant les périodes de stimulation (pour SAF) oR Plus de stimulation retour au départ (pour IOS). Cette différence est ensuite divisée par des valeurs de base pour obtenir une variation en% (voir les images résultant de la Fig. 3).
Figure 3 Odeur évoqués cartes d'activité dans l'OB à l'aide d'IOS et FAS imagerie. A. Vasculature de la dorsale OB visualisées sous lumière verte. Colombie-Britannique. IOS imagé (seul essai contre trois essais en moyenne respectivement) pour une présentation de l'hexanal 10s 20%. Les flèches blanches indiquent les régions sphériques d'intérêt activé par cette odeur. Ces cartes d'activation ont été obtenus en utilisant les cadres en moyenne pendant la première seconde après la fin de la stimulation d'odeurs (maximum de variation de réflectance -0,63% en A et -0,52% en B). Notez les zones noires de l'absorbance, où l'odeur d'activation a eu lieu. CD-ROM. SAF acquise séquentiellement dans la même souris pour l'odorant même (seul essai contre trois essais en moyenne respectiveLy). Ces cartes d'activation ont été obtenus en utilisant les cadres en moyenne pendant la première seconde après le début de la stimulation d'odeurs (maximum de variation 0,72% en fluorescence D et 0,66% en E). Notez que les zones blanches de l'émission de l'autofluorescence indiquées par des flèches noires correspondent aux zones noires dans l'IOS. L'aspect granuleux vu dans la carte SAF est due à la 4 par 4 binning requis pour l'amélioration de la sensibilité. SAF images n'ont pas été corrigées à partir autofluorescence de blanchiment. Les dimensions réelles des images BE: 0,7 mm de large x 1,2 mm de long.
Discussion
Dans cet article nous présentons IOS et le SAF techniques d'imagerie pour enregistrements in vivo des odeurs évoquées activités dans l'OB de la souris. Pour atteindre cet objectif est relativement simple et abordable à large champ de configuration d'imagerie optique est nécessaire. L'acquisition de l'imagerie de données nécessite une formation pour effectuer les procédures chirurgicales fines et éviter tout dommage causé à la mère ou le tissu cérébral. En particulier, les saignements majeurs seront enregistrées absorbent les photons pour l'imagerie et finissent par l'expérience.
Un des avantages de l'IOS et FAS imagerie est d'éviter l'injection de traceurs fluorescents qui pourraient entraîner une toxicité cellulaire ou des effets secondaires indésirables. Elles permettent d'aborder des questions au sujet des cartes olfactives ainsi codage spatial des stimuli sensoriels. Contrairement à l'imagerie 2-désoxyglucose, ils offrent la possibilité aux odeurs d'image de plusieurs dans un seul animal. Toutefois, depuis la pénétration des photons est limitée dans le tissu, IOS et le SAF sont limités à la partie dorsale de l'OBet ne peuvent pas être enregistrés à partir des régions ventrales.
Endogènes imagerie signal optique offre une excellente résolution spatiale pour l'imagerie in vivo. Technique des calculs améliorations concernent quantitative des composants vasculaires dans la réflexion des signaux 8,9 ainsi que la dynamique de l'oxygénation du sang et du volume lors de l'activation sensorielle 10. Imagerie Multiwavelength des approches d'imagerie IOS sont actuellement développés dans notre laboratoire pour quantifier pleinement la concentration d'hémoglobine totale et l'oxygénation de l'OB lors de l'activation sensorielle. Ces mesures spectroscopiques optiques ajouté au SAF imagerie donnera l'occasion de répondre à la relation non résolus entre la dynamique vasculaire et intracellulaires lors de l'activation sensorielle 11,12.
Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le "Agence Nationale de la Recherche" ANR-09-JCJC-0117-01 et "Neuropôle de Recherche Francilien-NERF" subvention pour Romain Chery. Nous remercions Françoise Lefebvre pour le développement de logiciels en C + + / Qt, et Laurent Pinot et Batiste Janvier pour aider à l'élaboration de la configuration de l'imagerie optique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imalgene | Merial | ||
| Rompun | Bayer AG | ||
| Agarose, type III-A | Sigma-Aldrich | A9793-50G | |
| Hexanal 98% | Aldrich | 115606-100ML |
References
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