Summary
Анализа количественно измерить трансформирующий фактор роста (TGF)-β-индуцированной вторжения в 3-мерном гели коллагена описано. Этот тест использует преимущества серии MCF10A клеточных линий, которые представляют различные стадии развития рака молочной железы. Этот метод может быть принята для использования с другими клеточными линиями и может быть использован для исследования других возможных активаторов или ингибиторов вторжения.
Abstract
TGF-β имеет противоположные роли в груди прогрессии рака, действуя как супрессоры опухолевого роста на начальном этапе, но стимулирующие инвазии и метастазирования на более поздней стадии 1,2. Более того, TGF-β, часто избыточно экспрессируется при раке молочной железы, и его экспрессия коррелирует с плохим прогнозом и метастазирования 3,4. Механизмов, посредством которых TGF-β вызывает вторжение не до конца понятны.
TGF-β вызывает ее клеточный ответ через TGF-β типа II (TβRII) и типа I (TβRI) рецепторы. По TGF-β-индуцированной heteromeric сложное образование, TβRII фосфорилирует TβRI. Активированный TβRI инициирует его внутриклеточной канонической сигнальный путь от фосфорилирования рецептора Smads (R-Smads), т.е. Smad2 и Smad3. Эти активированные R-Smads форме heteromeric комплексов с Smad4, которые накапливаются в ядре и регулируют транскрипцию генов-мишеней 5. В дополнение к ранее гвневписанной Smad пути, активация рецептора приводит к активации ряда других не Smad сигнальных путей, например Митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути 6.
Для изучения роли TGF-β в различных стадиях рака молочной железы, мы использовали системы клетки MCF10A. Эта система состоит из спонтанно увековечены MCF10A1 (M1) груди эпителиальных клеток 7, H-RAS преобразован М1-производных MCF10AneoT (M2), которая производит предраковых поражений у мышей, 8, и М2-производная MCF10CA1a (М4), которая была создана с М2 ксенотрансплантаты и форм высококачественного карциномы со способностью к метастазированию в легкие 9. Это MCF10A серия предлагает возможность изучать ответы клеток с различной степенью злокачественности, которые не искаженных различных генетических фоне.
Для анализа TGF-β-индуцированной вторжения, мы сгенерировали однотипных MCF10A сфероида клеточных культур embedded в 3D-матрицу коллагена в пробирке (рис. 1). Такие модели очень напоминают человеческих опухолей в естественных условиях путем создания градиента кислорода и питательных веществ, в результате активной и инвазивных клеток на улицу и покоя и даже некротических клеток внутри сфероида 10. Сфероид основаны анализы также показали, чтобы лучше резюмировать лекарственной устойчивостью, чем монослой культур 11. Это MCF10 3D модель системы позволяет исследовать воздействие TGF-β сигнализации на инвазивные свойства грудного клетки на различных стадиях злокачественных новообразований.
Protocol
1. Приготовление раствора Methocel (500 мл)
- Автоклав 6 г метилцеллюлозы в 500 мл флакон с магнитной мешалкой.
- Растворите метилцеллюлозы в 250 мл разогретой DMEM/F12 без сыворотки (60 ° C) в течение 20 мин.
- Добавить 250 мл DMEM/F12 (RT), содержащей 10% лошадиной сыворотки. Смешайте ночь (4 ° С).
- Очистить решение путем центрифугирования (5000 г, 2 часа, 4 ° С).
- Возьмите ясно очень вязкий раствор в новую пробирку (около 90-95% от исходного раствора).
- Хранить при температуре 4 ° С до использования.
2. Сфероид культуры
- Подготовка 20% Methocel раствор (10 мл Methocel и 40 мл питательной среды).
- Вымойте клетки дважды с PBS, добавить 0,1% трипсина и инкубировать клетки при 37 ° C
- Ресуспендируют клеток в питательную среду и подсчета клеток.
- Подготовка приостановление 10 000 клеток на мл в 20% Methocel.
- Добавить клеточной суспензии на 96 лунок с круглым дномuspension пластин (100 мкл на лунку).
- На следующий день, проверить сфероида образования в подвеску плит. Сфероидов будет готов к использованию через 1-3 дней.
3. Подготовка коллагена
- Подготовка на льду раствор 8 мл коллагена, 1 мл PBS 10x, 1 мл 0,1 N NaOH и 3 капли 0,1 N HCl. Проверьте, если рН 7,4 путем выявления некоторых из раствора на полосы рН показатель. Отрегулируйте рН, если вне диапазона.
- Добавить 50 мкл нейтрализованы раствора коллагена в лунки 96-луночного планшета
- Инкубировать при 37 ° С до коллаген затвердевает (90 мин).
- Подготовка Methocel-коллаген-лиганд решений на льду: для каждого лиганда пипетки 1 часть коллагена решение. Добавить 20 нг на мл коллагена TGF-β. После разбавления Methocel и диффузия по различным слоям, конечной концентрации TGF-β будет 5 нг / мл Смешать по вортексе. Добавьте 1 часть Methocel-решения. Смешайте по вортексе.
4. Сфероид вставлятьдинь
- Место 200 мкл наконечник которого составляет приблизительно 5 мм кончик отрезать, по 200 мкл пипетки. Соси одну сфероида с помощью пипетки и осторожно обходиться среды в пустую тарелку. Часы, если сфероид остается внутри наконечника. Сфероида видны как белые точки. Не отпуская поршень, подлизываться 100 мкл коллаген Methocel смеси и обойтись сфероида в коллагена смесь в коллаген-покрытием 96 лунок. Делайте это в течение 12 сфероидов для каждого условия.
- Давайте коллагена укрепить не менее 30 минут при температуре 37 ° C
- Удалить пузырьки воздуха с 200 мкл наконечник.
- Добавить 50 мкл среды с 1,6% сыворотки и ингибиторов растворяется в ДМСО. Для вспышки SB-431542 добавить 4 мкл исходного раствора (10 мМ) в 1 мл среды. После диффузии, конечная концентрация ингибитора будет 10 мкМ. TGF-β и ингибиторов останется ходе эксперимента. Сфотографируйте сфероидов под микроскопом использованием 40-кратном увеличении.
- После 4-х8h стимуляции с TGF-β и / или ингибиторов, сфотографировать сфероидов под микроскопом использованием 40-кратном увеличении.
- Измерьте площадь вторжения сфероидов после 2 дней и вычитать стартовой зоне. Измерение область сфероида: Открытые картинку из сфероида в Adobe Photoshop Extended (рис. 2A) и выберите Быстрый выбор инструмента (рис. 2В). Указатель мыши превращается в круг с "плюс" (+) знак (рис. 2С). При перемещении курсора на сфероид, Photoshop распознает границы сфероида. Если область за пределами сфероида выбран, этот регион может быть исключен из списка, нажав Alt ключа или с помощью отрицательного выбора инструмента на что указывает знак (-) на панели инструментов. Курсор превращается в круг с "минус" (-), знак и, перетащив курсор на неправильно выбранной области, эта область удаляется из списка (рис. 2D). В случае необходимости, несколько областей могут быть выбраны нажатием Ш.IFT кнопку. Чтобы работать более точно, размер указателя мыши можно регулировать путем изменения диаметра кисти на панели инструментов (рис. 2Е). Когда вся сфероида выбран, область выбора рассчитывается путем анализа-МЕРА в строке меню или нажатием Ctrl + Shift + M (рис. 2F). Окна измерения запись появится показывает имя файла и области выбора в пикселях, а также другие данные (рис. 2G). Если множественный выбор измеряются, первая строка показывает сумму всех областях. Измерения отдельных выбор представлены в линии ниже. Данные всех измерений могут быть экспортированы в текстовый файл и открыт в Excel.
5. Представитель результаты:
Примером сфероида анализа с MCF10A1 (M1) нормальная грудь эпителиальных клеток, H-RAS преобразован MCF10AneoT (M2) клеток и М2 полученных MCF10CA1a (М4) приведен на рис 3. M1 клетки показали лишь слабые вторжения безстимуляции, но значительно лучше, вторглись на стимуляцию TGF-β. В отличие от РАН трансформированных М1-М2 производных вторглись уже эффективно без того стимулов, и это еще больше увеличилась в 4-5 раз по TGF-β лечения. M4 клетки показали сильнейший вторжения, так и без TGF-β дополнение.
Далее, мы рассмотрели, можно ли вмешиваться в TGF-β-индуцированной вторжения в эту модель сфероида с использованием химических ингибиторов. Для этой цели мы использовали SB-431542, аналогов АТФ и селективный ингибитор киназы деятельности TβRI, а также активин типа IB рецепторов (ActRIB) и активин рецептор-подобных киназ (АЛК) 7 12. Как и ожидалось, SB-431542 мощно подавляется TGF-β-индуцированной вторжения в М1, М2 и М4 клетки (рис. 4), указывая, что TGF-β-индуцированной вторжение TβRI-киназы зависимыми. Кроме того, базальные вторжения сфероидов был также сильно тормозится, предполагая, что базальные вторжения также де-зависимы от TGF-β.
Рисунок 1. Технологическая схема 3D сфероида анализа. Во-первых, клетки высевают под не соблюдают условия в П-образной подвески плит. Клетки aggregrate в multcellular сфероидов и может быть встроен в коллагеновой матрице. В эту матрицу коллагена, они способны вторгаться.
Рисунок 2. Количественная области сфероидов использованием Adobe Photoshop Extended. (А) картина сфероида открыт в Adobe Photoshop Extendend (B) Выбор Быстрый Selection Tool (C) Перемещение курсора на сфероид, чтобы выбрать область сфероида (D) Удаление wongly включены области с помощью отрицательные Quick Selection Tool (E) Регулировка кисть размером Быстрый выбор инструмента для более точного выбора области (F) ВыборИзмерение команду для записи (G) Пример измерения записи.
Рисунок 3. TGF-β-индуцированной вторжения сфероидов спонтанно увековечены MCF10A1 (М1) () РАН трансформированных MCF10AneoT (M2 (B) и ее производных метастатическим MCF10CA1a (М4) (С). M1, M2 и M4 сфероидов встроенных в коллагена лечили 5ng/ml ТФР-β в течение 48 часов, как указано. AC представитель снимков, снятых в день вложение, а два дня спустя. D Относительная вторжение количественно, как площадь разницу в день 2 дня минус 0. Результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение Адаптировано из 13.
Рисунок 4. Базальные и TGF-β-индуцированной сфероида вторжения тормозится бу SB-431542. М1, М2 и М4 сфероидов были встроены в коллагена и обрабатывают 5ng/ml TGF-β и / или 10 мкМ SB-431 542, как указано. Представитель фотографии, сделанные после 2 дней (А). Относительная вторжение количественно, как площадь разницу в день 2 дня минус 0 (B). Результаты выражали в виде среднего ± стандартное отклонение Адаптировано из 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы создали сфероида модель, в которой MCF10A1 клетки и ее производных злокачественных вторгнуться в коллагеновой матрице в TGF-β-зависимым образом. Во-первых, сфероидов образуются в 96-скважин круглым дном подвеской плит в присутствии метилцеллюлозы. Конечно, также П-образные поли-НЕМА покрытие пластин могут быть использованы для этой цели. Метилцеллюлоза абсолютно необходимо на этом этапе, так как клетки умирают в отсутствие метилцеллюлозы. TGF-β добавляется непосредственно в коллаген-Methocel смеси, так как мы обнаружили, что клетки ответили менее хорошо к TGF-β, когда этот фактор был добавлен в среде топ оп из коллагена. Тем не менее, рекомендуется добавлять химические ингибиторы, растворенных в ДМСО не прямо на коллаген, так как ДМСО осаждается в icecold коллаген Methocel смеси. Таким образом, мы добавляем этих соединений в среде на верхней части коллагена.
Впоследствии клетки встраиваются в коллаген 3-dimensРациональная среду, чтобы они могли вторгнуться в коллагеновой матрице. При сравнении инвазивных свойств различных MCF10A1 клеточных линиях мы обнаружили, что базальные вторжения, а также TGF-β-индуцированной вторжения увеличились с относительно мягкими М1 клеток, до более высоких уровней в РАН трансформированных М2 производной, до еще более высокого уровня в метастатическим М4 вариант. Таким образом, инвазивные свойства коррелируют с относительной состояние агрессивности этих трех клеточных линий, 7,8,14.
Вложение сфероида в коллаген является важным шагом в анализе. Обнаружение сфероида на кончике пипетки может быть трудно при выполнении анализа на первые несколько раз. Можно избежать этого, собирая сфероидов в трубку, спиннинг их вниз, удаляя супернатант и ресуспендируйте сфероидов в коллаген-Methocel смеси. Это требует более сфероидов в качестве входных данных, как около 50% сфероидов теряется во время этого процесса. Кроме того, несколькосфероидов можете оказаться в одной скважине и могут лежать слишком близко друг от друга для анализа. Кроме того, желательно иметь не более одного сфероида на лунку, чтобы избежать возможности того, что сфероиды могут мешать друг другу (например, факторы, выделяющие роста). Поэтому ресуспендирования шагом является критическим шагом, используя этот метод.
Ограничение этого анализа является то, что мы анализируем 3 мерных анализа в 2-мерной плоскости. Как видно на рисунках 3 и 4, большинство клеток обычно вторгнуться в одной плоскости. Тем не менее, сфероидов, которые расположены очень близко к краю и вторгнуться в целом более подробно и по этой причине исключены из анализа. Конечно, можно было бы провести анализ в 3D, с тем чтобы получить более точный результат. Но это требует сложного оборудования и программного обеспечения и преимущества расчета объема вместо области не могут перевесить неприятности. Тем более, что мы обнаружили, что изменения в начальный размерв 3-мерном сфероидов, измеряемой в 2D, как правило, только 5-10%.
Другим недостатком этого метода является то, что изображение является трудоемким шагом, так как сфероидов расположены на разной высоте, что затрудняет автоматизированной обработки изображений. Также анализ шаг требует много времени и требует фотографии с хорошим контрастом от сфероида к матрице для того, чтобы использовать способности Photoshops автоматически распознавать границы сфероида. В случае, если контраст слишком низко, можно легко адаптировать яркость и контрастность использованием уровней и кривых команды в Photoshop. Еще один способ увеличить контраст будет использовать жизненно флуоресцентным красителем.
Как альтернативный способ количественного определения, можно было бы привлечь область вокруг сфероида вручную с помощью изображения J. до изображения J том, что она является бесплатной (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Однако мы обнаружили, ручной рисунок неправильной формы сфероидов вторглись в изображение Jтрудоемким шагом по сравнению с быстрой Selection Tool, Photoshop.
Протокол может быть адаптирована для расследования вторжения в другие клеточные линии, при условии, что клетки способны образовывать spheroids.Furthermore, оптимальной концентрации TGF-β, чтобы вызвать вторжение в клеточной линии могут быть разными. Во всех наших клеточных линий, TGF-β индуцирует вторжения на 5 нг / мл, хотя М4 работает лучше при использовании 2 нг / мл.
Кроме того, этот анализ может быть адаптирован для измерения инвазивного ответы на другие факторы роста, такие как эпителиальный фактор роста (ЭФР) или фактор роста гепатоцитов (HGF).
В наших тестах базальной и TGF-β-индуцированной вторжение сильно тормозится при обработке SB-431542, ингибитор типа я рецептора TGF-β. Это доказательство принципа, что химические ингибиторы могут быть использованы в этом анализе. Другие ингибиторы химические, такие как ингибиторы MMP, также успешно используется в концентрацииtions, рекомендованные производителем для монослоя культуры клеток.
После освоения этой техники, можно проверять действие химических ингибиторов, нокдаун или избыточная экспрессия генов на вторжение. Кроме того, путем расширения анализа в 24-луночный формат, можно выделить РНК с использованием фенол-хлороформ основе метода (например Trizol ® или Tripure), после чего кремний-столбца на основе очистки. Эта РНК могут быть использованы для количественной ПЦР в реальном времени.
Наше сфероид анализа вторжения напоминает в естественных условиях процесс более тесно, чем 2D-модели вторжения, потому, что клетки в сфероидов в различных метаболических состояниях и взаимодействуют более естественным образом со своим окружением 10. Мы провели пропидия йодидом и окрашивания флуоресцеин диацетат для проверки мертвых и живых клеток после вторжения анализа и отметил, что по аналогии с ситуацией в естественных условиях, клетки в центре мертвы и некротические, тогда как клетки на тОн внешнего края являются метаболически активными.
Мы использовали типа я коллагена, а затем Матригель, потому что несколько отчетов показали, что состав внеклеточного матрикса при раке молочной железы часто изменяется, в результате чего фиброзные очаги жесткая с высоким содержанием коллагена я. Было показано, что увеличение содержания коллагена я способствует образованию рака груди и вторжения 15 и связано с более частым проявлением метастазов 16. Многие клетки опухоли, таким образом, чтобы вторгнуться через коллагена I богатую среду для того, чтобы метастазы.
Некоторые 3D-моделей были разработаны в течение последних десятилетий. Клетки могут быть либо полностью встроены в в матрице или помещены в верхней части матрицы или полимерных эшафот 17,18. В 3D-модели, разработанной Bissell и сотрудников, клетки были выращены в восстановленной базальной мембраны (УКР) матрицы. Эта модель обеспечивает быстрый анализ проводить различия между нормальной и злокачественноймолочных эпителия, но сосредотачивается на морфологии клеток 19,20. Морфогенез и организации различных клеточных линий MCF10A обратно коррелирует со злокачественными опухолями 21,22. В других 3D моделей многоклеточных сфероидов показало же сопротивление цитотоксических препаратов в качестве исходной клеточной линии в живом организме, в то время как клетки монослоя не сделали 11. Также 3D культур линий MCF10A ячейки были использованы для оценки чувствительности к ингибиторам киназы 23. Наше сфероид модель дополняет эти анализы по акцентируя внимание на вторжение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны Кен Ивата (OSI Pharmaceuticals, Нью-Йорк, США) для реагентов и Фред Миллер (Barbara Ann Karmanos Рак Intitute, Детройт, США) для клеточных линий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| 96-well suspension plates | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates | Greiner Bio-One | 655 180 |
References
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J.
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H.
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
