Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Summary

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Abstract

TGF-β ha opuesto papel en la progresión del cáncer de mama al actuar como un supresor tumoral en la fase inicial, pero estimulando la invasión y metástasis en ^1,2 más adelante. Por otra parte, el TGF-β es frecuentemente sobreexpresado en el cáncer de mama y su expresión se correlaciona con mal pronóstico y la metástasis ^3,4. Los mecanismos por los que el TGF-β induce la invasión no se comprenden bien.

TGF-β induce la respuesta celular a través del tipo II de TGF-β (TβRII) y el tipo I (TβRI) receptores. TGF-β sobre la inducida por la formación de complejos heteroméricos, TβRII fosforila la TβRI. El TβRI activado inicia su vía de señalización intracelular canónico por la fosforilación de Smads receptor (R-Smads), es decir, Smad2 y Smad3. Estas activa R-Smads formar complejos con heteroméricos Smad4, que se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción de genes diana ^5. Además de los anteriores described vía Smad, los resultados de la activación del receptor en la activación de varias otras organizaciones no Smad vías de señalización, por ejemplo la proteína quinasa activadas por mitógeno (MAPK) vías ^6.

Para estudiar el papel del TGF-β en las diferentes etapas del cáncer de mama, hemos hecho uso del sistema de células MCF10A. Este sistema se compone de manera espontánea inmortalizado células de la mama MCF10A1 (M1) del epitelio ^7, el H-RAS transformó M1 derivados MCF10AneoT (M2), que produce lesiones premalignas en ratones ^8, y el MCF10CA1a M2 derivados (M4), que se estableció a partir xenoinjertos M2 y formas de alta carcinomas de grado con la posibilidad de metástasis en el pulmón ^9. Esta serie MCF10A ofrece la posibilidad de estudiar las respuestas de las células con diferentes grados de malignidad que no están sesgados por una base genética diferente.

Para el análisis de TGF-β inducida por la invasión, se generó homotípicos MCF10A células esferoide embe culturasñadido en una matriz de colágeno 3D in vitro (Fig. 1). Estos modelos se parecen mucho a los tumores humanos in vivo mediante el establecimiento de un gradiente de oxígeno y nutrientes, lo que resulta en células activas y las operaciones en el exterior y las células en reposo o incluso necrosis en el interior del esferoide ^10. Esferoide ensayos basados ​​también han demostrado una mejor resistencia a los medicamentos que recapitular monocapas ^11. Este sistema MCF10 modelo 3D nos permitió investigar el impacto de TGF-β señalización en las propiedades de las células de mama invasivo en las diferentes etapas de malignidad.

Protocol

1. Preparación de la solución Methocel (500 ml)

1. Autoclave de 6 g de metilcelulosa en una botella de 500 ml con agitador magnético.
2. Disolver la metilcelulosa en 250 ml de DMEM/F12 sin suero precalentado (60 ° C) durante 20 min.
3. Añadir 250 ml de DMEM/F12 (RT), que contiene 10% de suero de caballo. Mezcla durante la noche (4 ° C).
4. Clara la solución mediante centrifugación (5000 g, 2 h, 4 ° C).
5. Tome la solución clara de alta viscosidad a un nuevo tubo (aproximadamente el 90-95% de la solución madre).
6. Almacena a 4 º C hasta su uso.

2. Cultura esferoide

1. Prepare una solución al 20% metocel (10 ml metocel y 40 ml de medio de crecimiento).
2. Lavar las células dos veces con PBS, añadir tripsina al 0,1% y las células se incuban a 37 ° C
3. Resuspender las células en medio de crecimiento y el recuento de las células.
4. Preparar una suspensión de 10 000 células por ml en el 20% metocel.
5. Añadir la suspensión celular a la s 96 de fondo redondo yplacas USPENSIÓN (100 l por pocillo).
6. Al día siguiente, consulte la formación esferoide en las placas de suspensión. Esferoides estará listo para su uso después de 1-3 días.

3. Preparación de colágeno

1. Prepare en el hielo una solución de colágeno de 8 ml, 1 ml de PBS 10x, 1 ml de NaOH 0,1 N y 3 gotas de HCl 0,1 N. Compruebe si el pH es de 7.4 por manchar algo de la solución en las tiras indicadoras del pH. Ajustar el pH si fuera de rango.
2. Añadir 50 l de solución de colágeno neutralizado en los pocillos de una placa de 96 pocillos
3. Se incuba a 37 ° C hasta que el colágeno se solidifica (90 min).
4. Prepare metocel-ligando colágeno soluciones en el hielo: para cada pipeta ligando una parte de la solución de colágeno. Agregar 20 ng por ml de TGF-β colágeno. Después de la dilución con metocel y difusión sobre las diferentes capas, la concentración final de TGF-β será de 5 ng / ml Mezclar por agitación. Añadir una parte de metocel solución. Mezclar mediante agitación.

4. Esferoide incrustarding

1. Coloque una punta de 200 l que tiene aproximadamente 5 mm de la punta cortada, en una pipeta de 200 microlitros. Chupar un esferoide, con la pipeta y cuidadosamente dispensar el medio en un plato vacío. Ver si el esferoide se mantiene dentro de la punta. El esferoide es visible como un punto blanco. Sin soltar el émbolo, absorben 100 l colágeno metocel mezcla y vierta el esferoide en la mezcla de colágeno en el colágeno recubiertas de 96. Haga esto durante 12 esferoides para cada condición.
2. Deje que el colágeno se solidifican al menos 30 minutos a 37 ° C
3. Eliminar las burbujas de aire con una punta de 200 microlitros.
4. Añadir 50 l de medio con el 1,6% de suero y los inhibidores disueltos en DMSO. Para SB-431542 añadir 4 l de solución madre (10 mm) a 1 ml de medio. Después de la difusión, la concentración final de inhibidor de la será de 10 micras. TGF-β y los inhibidores mantendrá el curso del experimento. Tome fotos de los esferoides en el microscopio con aumento de 40x.
5. Después de 48h de la estimulación con TGF-β y / o inhibidores, tomar fotos de los esferoides en el microscopio con aumento de 40x.
6. Medir el área de los esferoides invasores después de 2 días y restar la zona de salida. La medición de la superficie de un esferoide: Abrir la imagen del esferoide en Adobe Photoshop Extended (figura 2A) y seleccionar la herramienta de selección rápida (Figura 2B). El puntero del ratón se transforma en un círculo con un 'plus' signo (+) (figura 2c). Mientras arrastra el cursor sobre el esferoide, Photoshop se reconocen las fronteras del esferoide. Si un área fuera del esferoide se selecciona, esta región puede ser excluido de la selección pulsando la tecla Alt o mediante el uso de la herramienta de selección negativa que se indica mediante un signo - en la barra de herramientas (). El cursor se convierte en un círculo con un "menos" signo (-) y arrastrando el cursor sobre el área seleccionada erróneamente, esta zona se retira de la selección (figura 2D). Si las regiones es necesario, pueden seleccionar múltiples pulsando el Shbotón ift. Para trabajar con mayor precisión, el tamaño del puntero del ratón se puede ajustar cambiando el diámetro del cepillo en la barra de herramientas (Figura 2E). Cuando el esferoide se selecciona todo el área de la selección se calcula a través de análisis, medida en la barra de menú, o pulsando Ctrl + Mayús + M (figura 2F). La ventana de grabación de medición aparecerá mostrando el nombre del archivo y el área de la selección en píxeles, así como otros datos (figura 2G). Si se miden varias selecciones, la primera línea muestra la suma de todas las áreas. Las medidas de las selecciones individuales se presentan en las líneas de abajo. Los datos de todas las mediciones se pueden exportar a un archivo de texto y se abre en Excel.

5. Los resultados representativos:

Un ejemplo de la prueba esferoide con MCF10A1 (M1), las células epiteliales de mama normales, H-RAS transformó MCF10AneoT (M2) y las células derivadas de MCF10CA1a M2 (M4) se da en la figura 3. Células M1 mostró sólo la invasión débil sinestimulación, pero invadido significativamente mejor a la estimulación por TGF-β. En contraste, el RAS-transforma M1-M2 derivados invadido ya de manera eficiente sin la adición de estímulos, lo que aumentó aún más a 4.5 veces el TGF-β tratamiento. Células M4 mostraron la mayor invasión, con y sin TGF-β además.

A continuación, examinó si se podría interferir con el TGF-β inducida por la invasión de este modelo esferoide el uso de inhibidores químicos. Para ello se utiliza el SB-431542, un análogo de la ATP y el inhibidor selectivo de la actividad quinasa de TβRI, así como la activina tipo IB receptor (ActRIB) y activin receptor de tipo quinasa (ALK) 7 ^12. Como era de esperar, SB-431542 potentemente inhibida TGF-β inducida por invasión de M1, M2 y M4 células (Fig. 4), lo que indica que el TGF-β invasión inducida es TβRI-quinasa dependiente. Además, la invasión basal de los esferoides también fue fuertemente inhibida, lo que sugiere que la invasión basal es también deindependiente de TGF-β.

Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo esferoide 3D. En primer lugar, las células se colocan en condiciones de no adherentes en forma de U placas suspensiones. Células aggregrate en esferoides multcellular y puede ser embebido en una matriz de colágeno. Dentro de esta matriz de colágeno, que son capaces de invadir.

Figura 2. Cuantificación de la zona de los esferoides con Adobe Photoshop Extended. (A) La imagen del esferoide se abre en Adobe Photoshop Extendend (B) Selección de la herramienta de selección rápida (C) Al arrastrar el cursor sobre el esferoide para seleccionar el área de la esferoidal (D) La eliminación de un área wongly incluyó el uso de la negativo herramienta de selección rápida (E) Ajuste de el tamaño del pincel de la herramienta de selección rápida para seleccionar con mayor precisión la zona (F) La selección de lamedición de comando que desea grabar (G) Ejemplo de un registro de medición.

Figura 3. TGF-β inducida por invasión de esferoides de forma espontánea inmortalizada MCF10A1 (M1) (A), RAS-transforma MCF10AneoT (M2 (B) y sus derivados MCF10CA1a metastásico (M4) (C). M1, M2 y M4 esferoides incrustado en colágeno fueron tratados con 5ng/ml de TGF-β durante 48 horas como se indica. AC imágenes representativas tomadas en el día de la incorporación y dos días después. invasión D relativa se cuantificó como la diferencia de área en el día 2 menos el día 0. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar Adaptado de ^13.

Figura 4. Invasión esferoide basal y TGF-β inducida se inhibe la by SB-431542. Esferoides M1, M2 y M4 fueron incorporados en el colágeno y tratados con TGF-β 5ng/ml y / o 10 M SB-431542, como se indica. Imágenes representativas tomadas después de 2 días (A). Invasión relativa se cuantificó como la diferencia de área en el día 2 menos el día 0 (B). Los resultados se expresan como media ± DE Adaptado de ^13.

Discussion

Hemos establecido un modelo esferoide en el que MCF10A1 células y sus derivados malignos invaden en una matriz de colágeno de manera TGF-β-dependiente. En primer lugar, esferoides se forman en 96 pozos de placas de suspensión de fondo redondo, con la presencia de metilcelulosa. Por supuesto, también en forma de U poli-HEMA placas recubiertas se pueden utilizar para este propósito. La metilcelulosa es absolutamente necesario en este paso, ya que las células se mueren en la ausencia de metilcelulosa. TGF-β se añade directamente a la mezcla de colágeno metocel ya que encontraron que las células respondieron tan bien a la TGF-β la que este factor se añadió a la parte superior op medio del colágeno. Sin embargo, es recomendable agregar inhibidores químicos disueltos en DMSO no directamente en el colágeno, ya que el DMSO se precipita en el icecold colágeno metocel mezcla. Por lo tanto, añadir estos compuestos en el medio en la parte superior del colágeno.

Posteriormente, las células están incrustadas en un colágeno de 3 dimensional entorno que les permita invadir la matriz de colágeno. Cuando se comparan las propiedades invasivas de las diferentes líneas celulares MCF10A1 se encontró que la invasión basal, así como el TGF-β inducida por aumento de la invasión de las células M1 relativamente benigno, a niveles más altos en el derivado de RAS-transforma M2, a niveles aún más altos en el metastásico M4 variante. Por lo tanto, las propiedades invasivas correlacionado con el estado relativo de la agresividad de estas tres líneas celulares ^7,8,14.

La incorporación del esferoide en el colágeno es un paso crítico en el ensayo. La detección del esferoide en la punta de la pipeta puede ser difícil cuando se realiza el ensayo de las primeras veces. Se puede evitar esto mediante la recopilación de los esferoides en un tubo, girando hacia abajo, eliminar el sobrenadante y resuspender los esferoides en la mezcla de colágeno metocel. Esto requiere más esferoides como entrada de alrededor del 50% de los esferoides se pierde durante el proceso. Además, los múltiplesesferoides puede terminar en un pozo y se puede estar demasiado cerca uno del otro para analizar. Además, es preferible que no más de un esferoide por pozo para evitar la posibilidad de que esferoides pueden interferir unas con otras (por ejemplo, secretan factores de crecimiento). Por lo tanto el paso de la resuspensión es un paso crítico con este método.

Una limitación de este ensayo es que se analiza un ensayo de tres dimensiones en un plano de dos dimensiones. Como se puede observar en las figuras 3 y 4, la mayoría de las células suelen invadir en el mismo plano. Sin embargo, esferoides que se encuentran muy cerca de la orilla del pozo invade generalmente más en profundidad y que por ese motivo excluidos del análisis. Por supuesto que sería posible realizar el análisis en 3D, con el fin de obtener un resultado más preciso. Pero esto requiere de hardware y software sofisticados y el beneficio de calcular el volumen en lugar de utilizar la zona no pueden superar los problemas. Sobre todo porque se encontró que la variación en el tamaño de partidade los esferoides de 3 dimensiones, medida en 2D, por lo general sólo el 5-10%.

Otra desventaja de este método es que la imagen es un paso mucho tiempo, ya que los esferoides se encuentran a diferentes alturas, lo que dificulta de imágenes automatizada. También la etapa de análisis es largo y requiere imágenes con buen contraste de esferoide a la matriz con el fin de hacer uso de la capacidad de photoshops para reconocer automáticamente la frontera del esferoide. En caso de que el contraste es demasiado bajo, se puede adaptar fácilmente el brillo y el contraste con los niveles de comandos y curvas en Photoshop. Otra forma de aumentar el contraste sería el uso de un colorante fluorescente vital.

Como una forma alternativa de cuantificación, se podría llamar el área alrededor del esferoide de forma manual utilizando la imagen J. Un adelanto de la imagen J es que es freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Sin embargo, encontramos el dibujo manual de la forma irregular de los esferoides invadido en la imagen Jun paso mucho tiempo en comparación con la herramienta de selección rápida de Photoshop.

El protocolo puede ser adaptado para investigar la invasión de otras líneas celulares, siempre y cuando las células son capaces de formar spheroids.Furthermore, la concentración óptima de TGF-β para inducir a la invasión de la línea celular podría ser diferente. En todas nuestras líneas de células, TGF-β induce la invasión a 5 ng / ml, aunque M4 funciona mejor cuando se utilizan 2 ng / ml.

Además, este ensayo puede ser adaptado para medir las respuestas invasivo para otros factores de crecimiento, como factor de crecimiento epitelial (EGF) o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

En nuestros ensayos de la invasión basal y TGF-β inducida-se inhibió por el tratamiento con SB-431542, un inhibidor del receptor de tipo I del TGF-β. Esto es una prueba del principio de que los inhibidores químicos pueden ser utilizados en este ensayo. Otros inhibidores químicos, como los inhibidores de MMP, también se han utilizado con éxito en las concentracionesciones recomendadas por el fabricante para el cultivo en monocapa de células.

Al dominar estas técnicas, se puede probar el efecto de inhibidores químicos, derribo o la sobreexpresión de los genes en la invasión. Además, mediante la ampliación del ensayo a un formato de 24 pocillos, se puede aislar el ARN utilizando un método de fenol-cloroformo-base (por ejemplo, Trizol ® o Tripure), seguido por una columna de base de sílice de limpieza. Este ARN puede ser utilizado para cuantitativas PCR en tiempo real.

Nuestro ensayo se asemeja a la invasión de esferoide en el proceso vivo más de cerca que los modelos de invasión en 2D, porque las células en esferoides se encuentran en diferentes estados metabólicos e interactuar de manera más natural con su entorno ^10. Hemos realizado yoduro de propidio y manchas diacetato de fluoresceína para comprobar si las células muertas y la vida después de la invasión de ensayo y observó que de manera similar a la situación in vivo, las células en el centro están muertos y necrótico, mientras que las células en el instante tque el borde exterior son metabólicamente activas.

Hemos utilizado el colágeno tipo I en lugar de matrigel, ya que diversos estudios han demostrado que la composición de la matriz extracelular en el cáncer de mama a menudo se altera, dando lugar a fibrosis rígida focos de colágeno con un alto contenido de I. Se ha demostrado que el aumento del colágeno I contenido promueve la formación de cáncer de mama y la invasión de ¹⁵ y se asocia con una mayor incidencia de metástasis ^16. Muchas células del tumor por lo tanto tienen que invadir a través de un ambiente rico colágeno I con el fin de hacer metástasis.

Varios modelos en 3D se han desarrollado en las últimas décadas. Las células pueden ser totalmente inmersa dentro de una matriz o colocado en la parte superior de una matriz polimérica o un andamio ^17,18. En un modelo en 3D desarrollado por Bissell y compañeros de trabajo, las células fueron cultivadas en una membrana basal reconstituida (GBR) de la matriz. Este modelo ofrece un ensayo rápido para distinguir entre normales y malignasepitelio mamario, pero se centra en la morfología celular ^19,20. Morfogénesis y la organización de las líneas celulares distintas MCF10A inversamente correlacionado con malignidad ^21,22. En otros modelos 3D esferoides multicelulares mostraron la misma resistencia a los fármacos citotóxicos como la línea celular de los padres en vivo, mientras que las células en monocapas no lo hicieron ^11. También las culturas 3D de líneas de células MCF10A se han utilizado para evaluar la sensibilidad a los inhibidores de quinasa ^23. Nuestro modelo esferoide complementa estos ensayos por centrándose concretamente en la invasión.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck & Co., Inc.	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-One	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-One	655 180