Summary
Key teknikker, der skal bruges i evalueringen af
Abstract
Vulvovaginal candidiasis (VVC), forårsaget af Candida arter, er en svampeinfektion i den nedre kvindelige kønsorganer, der rammer cirka 75% af ellers raske kvinder i løbet af deres reproduktive år 18,32-34. Disponerende faktorer omfatter anvendelse af antibiotika, ukontrolleret diabetes og forstyrrelse i reproduktive hormon niveauer på grund af graviditet, p-piller eller hormonbehandling behandlingsformer 33,34. Tilbagevendende VVC (RVVC), defineret som tre eller flere episoder om året, påvirker et separate 5 til 8% af kvinder uden disponerende faktorer 33.
En eksperimentel musemodel af VVC er blevet etableret og bruges til at studere patogenese og slimhinde vært reaktion på Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Denne model er også blevet ansat til at afprøve mulige antimykotika in vivo 13,24. Modellen kræver, at dyrene holdes i en tilstand af pseudoestrus for optimal Candida kolonisering / infektion 6,14,23. Under sådanne betingelser, vil vaccinerede dyr have påviselige vaginal svampeinfektion byrde for uger til måneder. Tidligere studier viser en meget høj parallel mellem den dyre model og infektioner hos mennesker i forhold til immunologiske og fysiologiske egenskaber 3,16,21. Forskelle, dog omfatter manglende Candida som normale vaginale flora og en neutral vaginal pH i mus.
Her har vi demonstrere en række centrale metoder i mus vaginitis model, der omfatter vaginal podning, hurtig indsamling af vaginal prøver, vurdering af vaginal svamp byrde, og væv forberedelserne til cellulære udtræk / isolation. Dette efterfølges af repræsentative resultater for bestanddele af vaginal udskylning væske, svamp byrde, og dræning lymfeknude leukocytter udbytte. Med brug af bedøvelse, kan lavage prøverne indsamlet på forskellige tidspunkter på samme mus for langsgående evaluering afinfektion / kolonisering. Desuden er denne model kræver ingen immunosuppressive midler til at iværksætte infektion, så immunologiske undersøgelser under definerede vært betingelser. Endelig model og hver teknik introduceret her potentielt kan give anledning til brug af metoder til at undersøge andre smitsomme sygdomme i de nedre kvindelige kønsorganer (bakterier, parasitter, viral) og de respektive lokale eller systemiske vært forsvar.
Protocol
1. Vaginal podning med Candida albicans
- Tre dage før podningen, mens fastholdelse dyret til at udsætte maven, indsprøjtes 100 μl af sesamolie indeholder 0,1-0,5 mg β-estradiol subkutant i den nederste del af maven. Advance nålen omkring 5 til 10 mm lateralt for huden for at minimere udsivning fra injektionsstedet.
Subkutan administration af østrogen i underlivet er optimal i denne model på grund af den tætte nærhed til kønsorganerne. Effektive doser kan variere afhængigt af musen stammer, alder eller østrogen derivater. I tidligere undersøgelser med CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), BALB / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) mus på 6-8 uger gammel, var 0,1 mg/100 μl fundet effektive fremgår af fortykkelse af vaginal væggen, nedsat vaginal slim ogøget epitelcelle hamskifte. Mus ovenstående behandles med østrogen ved denne koncentration udstille i overensstemmelse vaginal kolonisering med Candida. For podning på mus af andre stammer og aldre, er en pilotundersøgelse anbefales for at sikre effektiviteten af østrogen under de ændrede betingelser og øge østrogen dosis, hvis det er nødvendigt.
Den østrogen Løsningen skal forberedes frisk hver gang på dagen for injektionen. For at sikre fuldstændig opløselighed af østrogen i sesamolie, blandes grundigt løsning med en vortex mixer og varme sporadisk ved 37 ° C. Gentag injektionen hver uge i hele den undersøgte periode. - For at forberede inokulum, tilføje en loopful af C. albicans blastoconidia fra en nylig subkultur forberedelse på Sabouraud-dextrose (SDA) til 10 ml Phytone-pepton bouillon suppleret med 0,1% glucose. Inkubér bouillon kultur til stationære fase til 18 timer ved 25 ° C i et rystevandbad.
- Efter inkubation, th indsamlee bouillon kultur i en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 800 xg i 5 min. Vask pellet to gange med steril PBS.
- Optæl levedygtige blastoconidia på et hemocytometer ved trypan blåt farvestof udstødelse. Juster cellekoncentrationen til 2,5 x 10 6 / ml (eller til en ønsket inokulum koncentration) i sterile PBS.
- For at stabilisere musen, skal du holde haleroden med to fingre og løft hoften opad, således at skedeåbningen vender mod dig selv (Figur 1A). Det er ideelt, hvis musen er placeret på en flad revet overflade (f.eks bur øverst), så musen kan yde modstand mod halen tilbageholdenhed.
- Pipette 20 μl (eller et ønsket volumen ikke overstiger 20 μl) af inokulum suspension ved at sætte pipettespidsen ca 5 mm dybt ind i skeden lumen (Figur 1B). Udfør dette trin, så hurtigt og skånsomt som muligt for at minimere lidelse i mus.
2. Vaginal lavages
- Efter eutanasi (eller anæstesi), hgamle musen nedad ved haleroden med to fingre, så skedeåbningen bliver udsat for.
- Udskylning af vaginal lumen ved at indføre 100 μl i sterile PBS med gentagne aspiration og agitation med en pipette spids. Pipettespidsen kan blive tilstoppet med celler. Hvis dette sker, udlevere det hindrer cellerne og fortsætte lavaging med de resterende PBS i skeden. Saml de lavage væske ind i et mikrocentrifugerør.
- Alternativt kan vaginal lavages udføres på bedøvede mus med isofluran inhalant anæstesi. For dette, udsætte mus til fordampet isofluran, indtil de er fuldt bedøvet (~ 30 sek.). Hold mus nedad ved haleroden og forsigtigt lavage vaginal lumen med 50 μl af sterile PBS. Sørg for at undgå barske agitation med en pipette spids for at minimere traume til vagina under denne procedure. Bedøvet mus skal komme fra anæstesi inden for 30 sekunder af eksponering til den omgivende luft.
Isoflurankan være fordampet ved hjælp af en isofluran vaporizer og O 2 (foretrukket) eller en standard-slip-system lukkede bedøvende kammer uden vaporizer systemet (kræver nøje overvågning af dyret, mens bedøvet for at undgå åndedrætsbesvær).
Vaginal lavages på bedøvede mus bør være den foretrukne metode for langsgående udskylning prøver på samme mus. Fortløbende lavaging påvirker ikke vurderingen af svampe byrde over tid 41.
- For våd-mount præparater, overføre 10 μl af udskylning væske på en glasplade og observere på 400-1000x forstørrelse ved lysmikroskopi. Derudover kan cellulære fraktioner af lavage væske, der farves til at undersøge celle og nukleare morphologies. For smear præparater, overføre 10 μl af udskylning væske på en glasplade og forsigtigt spredt ved hjælp af den ydre mur af en pipette spids. Bevar smøre prøver med CytoPrep fiksativ og plette af standarden Papanicolaou teknik (celleprøve). Overhold ved 400 × forstørrelse ved lysmikroskopi.
3. Kvantificering af vaginal svampeinfektion byrde
- I en 96 vel rundbundet plade, overføre udskylning væske ind i en brønd i den øverste række og 180 μl af sterile PBS i følgende 5 brønde i denne kolonne (ned pladen).
- Gør 1:10 serielle fortyndinger af vaginal udskylning væske ved at overføre de 20 μl af væsken til den næste godt i kolonnen. Bland omhyggeligt ved gentagen aspiration før hver overførsel. Serielle fortyndinger af op til 12 lavage prøver (en hel vandret række) kan udføres samtidig med en 12-kanals pipette.
- Start med den laveste fortynding, 10 μl af prøven overføres på Sabouraud-dextrose (SDA). Plettering på op til 36 prøver kan udføres på 1 plade ved hjælp af SDA udarbejdet i firkantede petriskåle med gitter og en justerbar afstand multikanalpipette.
- Optæl kolonidannende enheder (CFUs) efter inkubation ved 34 ° C feller 48 h.
4. Vaginal væv udvinding
- Efter vaginal udskylning procedure, lægge aflivet musen på ryggen og mætte lysken med 70% ethanol. Brug et par pincet, løfte urin åbning opad, så skedeåbningen bliver udsat for.
- Sæt et par buede tang i skeden lumen, og find livmoderhalsen. Samtidig opretholde et fast greb med pincet, ekstrakt livmoderhalsen gennem skeden hulrum (figur 2A-C).
- Excise skeden på bunden af skedeåbningen og derefter fjerne livmoderhalsen fra skeden med kirurgiske sakse. Husk, at det vaginale væv er involuted (indvendige epitel-side af skeden er eksponeret udad). Det væv kan være enten lateralt omvendt at fastholde den oprindelige retning af skeden eller åbnet i et ark ved at gøre en lateral incision.
Fjernede vaginal væv kan bruges til 1) lymfocyt-ekstraktion efter collagenase fordøjelse (~ 1 × 10 4 / mus) 40, 2) epitelcelle isolation følgende dispase fordøjelse (~ 5 × 10 4 / mus) 28, 3) frosset eller paraffinindstøbte præparater til histologiske analyser 25.
5. Lumbal lymfeknude excision
- Efter vaginal udskylning procedure, lægge aflivet musen på ryggen og mætte maven med 70% ethanol. Lav en lateral snit fra den nederste del af maven til brystet og eksponere de indre organer. Brug et par tænger i begge hænder, skal du flytte tarmene opad, således at den centrale blodkar bliver synlige.
- Find den ringere Vena cava og abdominal aorta. Normalt kan et par af lumbal lymfeknuder identificeres ved siden af den abdominale aorta, ligger cirka halvvejs mellem oprindelse af nyre-og fælles iliaca arterier 39. Disse lymfeknuder kan visuelt skelnes fra fedtvæv af elastisk teksturog er lettere og mere uigennemsigtig i farve i forhold til fedtvæv (Figur 3). Disse lymfeknuder bliver væsentligt større i inficerede dyr i forhold til endnu ikke podet dyr.
- Excise lymfeknuder ved at placere microforceps under knuden og træk blidt op til adskilt fra omkringliggende væv.
6. Isolering af lymfoide celler i single-cellesuspensioner
- Overførsel lymfeknuder på en steril trådnet skærm (ca. 3 x 3 cm 2 i størrelse) placeret inde i et sterilt glas petriskål indeholder ~ 10 ml Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) (Figur 4).
- Med petriskål hælder lidt, skal du trykke på lymfeknuder mod skærmen med en sprøjte stempel hoved. Sørg for at bryde alle lymfeknuder, således at den cellulære indholdet af noder passere gennem skærmen, mens de ikke-cellulære komponenter i noder (dvs., membraner, stroma, fedt) forbliver på skærmen.
- Brug af samme stempel og sprøjte aspireres than HBSS indeholder celler. Vask skærmen med ~ 5 ml HBSS og indsamle de resterende væske i en 15 ml konisk rør.
- Centrifugeres ved 800 xg i 10 min. Aspirer fede indskud i toppen af væsken med en pipette før kassere væsken. Vask cellepelleten tre gange med HBSS. Resuspender pellet i 1 ml HBSS og tælle levedygtige celler ved trypan blåt farvestof udstødelse.
7. Repræsentative resultater:
Den cellulære fraktioner af vaginal udskylning væske fra> 4-dages podet mus består typisk af Candida, epitelceller og cellulære infiltrerer (Figur 5). Ved wet-mount mikroskopi, kan Candida være visuelt identificeres ved tilstedeværelsen af hyfer samt gær (Figur 5A). Smøre præparater af vaginal udskylning væske kan farves ved Papanicolaou teknik til at undersøge epitelceller og infiltrerer leukocytter, hvoraf de vigtigste celler er neutrofiler identificeret af tri-nuclear lapper (Figur 5B). Meget få neutrofiler, om nogen, er fundet i endnu ikke podet mus (figur 5C) 41.
Et eksempel på vaginal svampeinfektion byrde er vist i figur 6. Vaginal lavage fluid indsamlet på bestemte tidspunkter dyrkes for CFU tælling (figur 6A). Vaginal kolonisation / infektion med Candida fortsætter i ugevis i østrogen-behandlede podet mus (figur 6B), mens Candida undlader at etablere vaginal kolonisering i ikke-østrogen-behandlet podet mus (Figur 6C). Østrogen-behandlede endnu ikke podet mus forblive negativ for Candida hele tiden (data ikke vist). Desuden kan vaginal lavages udføres enten én gang på separate mus ved hvert tidspunkt eller på langs i samme mus under bedøvelse.
Columna lymfeknuder er de primære dræner lymfeknuder i kønsorganerne og de mest relevante sted at evaluere for systemisk immunrespons på en vaginal udfordring. NOTE, at disse lymfeknuder kan blive udvidet i podede mus, mens de normalt fremstår ganske lille i endnu ikke podet mus. Leukocyt cellulære inddrivelser ligger typisk fra 8 × 10 5 / endnu ikke podet mus til 5 × 10 6 / podet mus. Ud over at lumbal lymfeknuder, kan lyske, knæhaselymfeknuderne og mesenteriallymfeknuder også bruges.
Figur 1. Vaginal podning med Candida. A) En mus behersket til podning. Musen er placeret på en wire bur indsætte og ejes af haleroden, en anelse opad for at løfte benene og eksponere skedeåbningen. Hoften på musen kan stabiliseres med samme hånd som det forsøger at modstå halen tilbageholdenhed. B) Indførelse af inokulum ind i skeden lumen. En pipette spids sættes forsigtigt omkring 5 mm dybt ind i skeden lumen. Suspensionen inokulum er derefter deponeres.
Figur 2. Vaginal væv udvinding. AB) Udvinding af livmoderhalsen. Livmoderhalsen er placeret med buede pincet og udsatte udad gennem vaginal hulrum. Når ud af vaginal hulrum, er livmoderhalsen yderligere trukket udad til fuldt ud at eksponere skeden. C) Udvinding af skeden. Skeden er fjernet fra vulva med en saks. Når fritliggende, skal du fjerne livmoderhalsen fra skeden.
Figur 3. Identifikation af lumbal lymfeknuder. Placeringen af lænde lymfeknuder blandt de omkringliggende organer / blodkar i nærheden af bækken er angivet. A, abdominal aorta. B, urinblæren. C, fælles iliaca arterie. I, tarmene. L, lever. R, endetarmen. S, milt. U, livmoder.
Figur 4. Den lumbal lymfeknuder placeres på et trådnet skærm. Lymfeknuder samles på skærmen placeret i en petriskål med HBSS. Lymfeknuder er presset mod skærmen med en sprøjte stempel til at opnå lymfoide celler i encellede suspensioner.
Figur 5. Cellulære fraktioner af vaginal udskylning væske fra podet mus. A) Wet-mount og B) celleprøve præparater af vaginal udskylning prøver indsamlet 4 dage efter-inokulering og C) fra endnu ikke podet mus. Billederne bliver vist på 1000 × (A) eller 400 × (B, C) forstørrelse. Indsatsen i B viser den nukleare morfologi af vaginal neutrofiler ved 1000 ×. Candida gær (Y) og hyfer (H), epitelceller (EF) og neutrohils (N) er angivet.
Figur 6. Detection af vaginal svampeinfektion byrde. A) repræsentant C. albicans kolonier dyrkes på et SDA plade. Neat (N) lavage prøver fra seks forskellige podet mus (øverste række) blev serielt fortyndet og dyrkes for CFU tælling. B) Kvantificering af vaginal svampeinfektion byrde i østrogen-behandlet og C) ikke-østrogen-behandlede mus. Cfu/100 μl af udskylning væske fra inokuleres mus blev vurderet på angivne tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En eksperimentel musemodel af Candida vaginitis er blevet etableret, og historisk set brugt til de sidste par årtier for at studere mucosal vært reaktion på Candida samt til testning antimykotika 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. De protokoller, der præsenteres her indarbejde effektive og mindre arbejdskrævende metoder, og synes at være en af de mest optimerede modelsystemer af Candida vaginitis beskrevet til dato. Disse teknikker muliggør hurtig kvantificering af svampe byrde og indsamling af vaginal prøver. Desuden tidligere undersøgelser afprøve flere haplotypic stammer af mus (n = 13) og forskellige tidspunkter efter podningen viste tilsvarende niveauer af variabilitet i svampe byrde og vært reaktioner på vaginal kolonisering med Candida 2,6,41. Derfor kan denne model tilpasses til de eksisterende protokoller uden begrænsninger på musen stammer eller varigheden af infektionen. Imidlertid bør man erkende, atvariabilitet i vaginal svampeinfektion byrde kan være høj, mellem dyr får de samme inokulum (Figur 6B). Der er dokumentation for, at variabilitet opstår på grund af forskellige grader af tidlig tilslutning til vaginale epitel 41. Derfor er 7-10 mus / gruppe foreslået til statistiske formål.
Variabilitet i vaginal svampeinfektion byrde er også blevet påvist mellem forskellige stammer af C. albicans, hvilket tyder på, at ikke alle stammer af C. albicans har kapacitet til på samme måde kolonisere musen skeden. For eksempel, C. albicans 3153A (lab stamme) anvendes i denne protokol er blevet rapporteret til højere vaginal kolonisering end SC5314 (klinisk isolere), hvor en større inoculum (> en log) vil være påkrævet for at opnå samme niveau af vaginal svampeinfektion byrde set med 3153A 27. Faktisk har et meget varierende vaginal kolonisation med flere kliniske isolater blevet dokumenteret 36. Derfor bør man være TakDA når det bestemmes en optimal inokulum til hver C. albicans pres for at sikre en ensartet kolonisering hos mus. Typisk betyder CFUs spænder fra 5 x 10 4 til 5 x 10 5 / 100 μl lavage væske bør opdages for konsekvent kolonisering. Til vurdering af vaginal svamp byrde, er kvantificering af CFUs ved lavages passer til denne model som Candida blastoconidia og hyfer normalt ikke trænge ind bag de overfladiske lag af vaginale epitel. Vores tidligere histologiske post-evaluering af udskylning vaginal væv sjældent viste rester af Candida 25,41. Men vi erkender muligheden for, at hyfer kunne miscounted så de vokser som en enkelt koloni på agar plade og måske ikke afspejler nøjagtigt svampe byrde. Som en alternativ metode til CFU tælling, et nyudviklet in vivo imaging teknik er blevet rapporteret med succes vurdere vaginal svampeinfektion byrde, når du bruger gensplejset selvlysende C. albicans 9,29. Desuden kan protokollen ændres til at fremkalde C. glabrata kolonisering i diabetiske dyr 15,20. Til dato har musemodeller for andre ikke-C. Albicans-induceret vaginitis ikke været rapporteret.
Østrogen administration er afgørende for denne model, indleder robust vaginal kolonisering med Candida 6,14,23. Ud over at subkutan injektion af estradiol i sesamolie suspension, injektion af vand-opløselige estradiol i PBS og intradermal implantation af en kontrolleret frigivelse østradiol pellet er alternative metoder til østrogen administration og har været ansat i andre musemodeller af kvindelige kønsorganer infektioner 10. , 35. Krav om højt østrogen i denne model kan forklares med to fysiologiske faktorer. Den ene er, at forhøjet østrogen fremmer lagdeling af vaginale epitel 5,8,30. Fortykket epitel fra øget epitelcelleproliferation kan alleOW Candida at få en bedre overholdelse af vaginal væggen og efterfølgende kolonisering. For det andet er vaginalt epitel celler, der har høj glykogen indhold. En øget væv østrogen-niveau resulterer i aflejring af glykogen i vaginal vægge 30. Forhøjet glykogen i vaginal mikromiljø kan til gengæld give mulighed Candida til at blomstre ved at give ekstra næringsstoffer. Forrige immune analyser viste, at eksogene østrogen ikke påvirkede celleadhæsionsmolekyle udtryk 40. En ulempe ved at behandle dyrene med eksogene østrogen er, at forhøjet østrogen har også været kendt for at fremme tilgroning af vaginal kommensale flora 30. Da sammensætningen af flora kan variere betydeligt mellem dyr, kan dette tilføje en variabel, hvor kommensale organismer kunne påvirke Candida vækst eller modulere vært svar. I betragtning af dette spørgsmål, kræver model østrogen-behandlede kontrol (endnu ikke podet) dyr, der skal indgå ialle eksperimenter og analyseret parallelt.
I denne musemodel, kan effekten af anti-svampe agenter foretage en nøjagtig vurdering af de protokoller, der er beskrevet heri, som kan give afgørende in vivo test fører til udvikling af en mulig behandling til klinisk brug. Faktisk giver den robuste karakter af modellen gode tegn på klinisk effekt. Ud over brugen af østrogen, fremmer neutral vaginal pH i mus vækst af hyfer, en patogen form af Candida ses i alle podede mus. Svarende til kliniske observationer, en robust vaginal neutrofil migration sker i en delmængde af mus uden at påvirke svampe byrde 31,41. Tilstedeværelsen af neutrofiler er fremtrædende hos kvinder under symptomatisk vaginitis og synes at parallelle mus efter podningen 12,41. Siden andre kliniske symptomer (dvs. kløe, hævelser) ikke kan præcist målbare i mus, vurderingen af vaginal neutrofilerfungerer som en enkel, men pålidelig indikator for inflammation (symptomer) i denne model.
Den mikroskopi af vaginal udskylning væsken vist i figur 5 er rutinemæssigt udført i vores laboratorium for at vurdere Candida kolonisering og vaginal inflammation. Desuden kan hyphal scoring også anvendes som et mål for infektion. Derefter kan den cellulære og opløselige fraktioner af lavage væske skal bevares og cryo-arkiverede for fremtidige analyser. Det skal bemærkes, er en fordelagtig træk ved den protokol, vaginal lavages kan udføres på langs i den samme mus under bedøvelse. Vores tidligere undersøgelser har bekræftet, at langsgående evaluering ikke har indflydelse på bedømmelsen af vaginal svampeinfektion byrde. Denne fremgangsmåde er særlig fordelagtig i de tilfælde, hvor langsgående analyser af infektion ønskes.
Endelig har vi udviklet en mindre invasiv excision metode til vagina. Dette effektiv og hurtig teknik kræver ingen snit iunderlivet eller nogen indre organer, mens resten af kønsorganerne intakt. En anden nyttig funktion ved denne model er den manglende krav om immunsuppressive midler til at iværksætte Candida kolonisering. Dette er især vigtigt, fordi at bevare de naturlige immunstatus værten er et kritisk aspekt af immunologiske undersøgelser og vært svar på en mikrobiel udfordring. Derfor kunne væv og celler isoleres ved disse metoder kan anvendes i forskellige in vitro-immune assays.
Afslutningsvis tilbyder vi flere vigtige funktioner og repræsentative resultater af eksperimentel model af vaginal candidiasis. Ud over C. albicans-induceret vaginitis, har infektioner af andre patogener af de kvindelige nedre kønsorganer, herunder Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis og Herpes simplex virus blevet undersøgt ved hjælp af musen modeller, hvor organismerne er intravaginalt introduceret i hormon-behandlede mus 1,7,10,22,26,35,38. Derfor kan de teknikker, der er nyttige for undersøgelser med Candida vaginitis skal anvendes på og potentielt fremme metoder til at studere patogenese og vært immunrespons til andre smitsomme sygdomme i de kvindelige nedre kønsorganer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Dette arbejde blev også delvist understøttet af Louisiana Vaccine centrale og sydlige Louisiana Institut for smitsomme sygdomme forskning sponsoreret af Louisiana bestyrelse Regents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female CBA/J mice | Charles River Laboratories | 01C38 | 5-6 weeks of age |
| Candida albicans (3153A) | National Collection of Pathogenic Fungi, UK | NCPF3153 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547 | D–s not need to be pre-sterilized before use |
| Β-estradiol 17-valerate | Sigma-Aldrich | E1631 | 0.1-0.5mg in sesame oil |
| Phytone peptone | BD Biosciences | 211906 | Supplement with 0.1% glucose |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Sabouraud dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | |
| Collagenase type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | 0.25% |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 1.7 U/ml |
| Wire mesh screens | TWP | 060X060S0065W36T | No. 60 mesh, stainless |
| Hanks’ balanced salt solution | Invitrogen | 24020-117 | |
| CytoPrep fixative | Fisher Scientific | 12-570-10 | Preserves smear slides |
| Papanicolaou stain EA-65 | EMD Millipore | 7054X-85 | |
| Papanicolaou stain OG-6 | EMD Millipore | 7052X-85 | |
| Harris’ Alum hematoxylin | EMD Millipore | 638A-85 | |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber |
References
- Abraham, M. C. Inducible immunity to Trichomonas vaginalis in a mouse model of vaginal infection. Infect. Immun. 64, 3571-3571 (1996).
- Black, C. A. Major histocompatibility haplotype does not impact the course of experimentally induced murine vaginal candidiasis. Lab. Anim. Sci. 49 (6), 668-668 (1999).
- Black, C. A. Acute neutropenia decreases inflammation associated with murine vaginal candidiasis but has no effect on the course of infection. Inf. Immun. 66, 1273-1273 (1998).
- Black, C. A. Increased severity of Candida vaginitis in BALB/c nu/nu mice versus the parent strain is not abrogated by adoptive transfer of T cell enriched lymphocytes. J. Reprod. Immunol. 45, 1-1 (1999).
- Buchannan, D. L. Role of stromal and epithelial estrogen receptors in vaginal epithelial proliferation, stratification, and cornification. Endocrinology. 139 (10), 4345-4345 (1998).
- Clemons, K. V. Genetic susceptibility of mice to Candida albicans vaginitis correlates with host estrogen sensitivity. Infect. Immun. 72, 4878-4878 (2004).
- Conrady, C. D., Halford, W. P., Carr, D. J. Loss of the type I interferon pathway increases vulnerability of mice to genital Herpes simplex virus 2 infection. J. Virol. 85 (4), 1625-1625 (2011).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of estromal-epithelial interaction in hormonal responses. Arch Histol Cytol. 67 (5), 417-417 (2004).
- Enjalbert, B. A multifunctional, synthetic Caussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. 77 (11), 4847-4847 (2009).
- Feinen, B. Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection. Mucosal Immunol. 3 (3), 312-312 (2010).
- Fidel, P. L. Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis. Med. Mycol. 40, 359-359 (2002).
- Fidel, P. L. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect. Immun. 72, 2939-2939 (2004).
- Fidel, P. L., Cutright, J. L., Sobel, J. D. Efficacy of D0870 treatment of experimental Candida vaginitis. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, 1455-1455 (1997).
- Fidel, P. L., Cutright, J. L., Steele, C. Effects of Reproductive hormones on experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 68, 651-651 (2000).
- Fidel, P. L. A murine model of Candida glabrata vaginitis. J. Inf. Dis. 173, 425-425 (1996).
- Fidel, P. L. Analysis of vaginal cell populations during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 3135-3135 (1999).
- Fidel, P. L., Lynch, M. E., Sobel, J. D. Candida-specific cell-mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 61, 1990-1990 (1993).
- Fidel, P. L., Sobel, J. D. Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Microbiol. Rev. 9. 9, 335-335 (1996).
- Fidel, P. L., Sobel, J. D. Murine Models of Candida Vaginal Infections, In Experimental models in antimicrobial chemotherapy. Zak, O., Sande, M. , 2nd ed, Academic Press Ltd. London, UK. 741-748 (1999).
- Fidel, P. L., Vazquez, J. A., Sobel, J. D. Candida glabrata: Review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans. Clin. Microbiol. Rev. 12, 80-80 (1999).
- Fulurija, A., Ashman, R. B., Papadimitriou, J. M. Neutrophil depletion increases susceptibility to systemic and vaginal candidiasis in mice, and reveals differences between brain and kidney in mechanisms of host resistance. Microbiology. 142, 3487-3487 (1996).
- Gill, N. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269 (1), 29-29 (2011).
- Hamad, M., Abu-Elteen, K. H., Ghaleb, M. Estrogen-dependent induction of persistent vaginal candidosis in naive mice. Cell. Immunol. 47 (7), 304-304 (2004).
- Hamad, M. Utility of the oestrogen-dependent vaginal candidosis murine model in evaluating the efficacy of various therapies against vaginal Candida albicans infection. Mycoses. 49 (2), 104-104 (2006).
- LeBlanc, D. M., Barousse, M. M., Fidel, P. L. A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).
- McGrory, T., Garber, G. E. Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection. Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).
- Nomanbhoy, F. Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity. Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).
- Pietrella, D. A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique. Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).
- Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora. Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).
- Saavedra, M. Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).
- Sobel, J. D. Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis. Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).
- Sobel, J. D. Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Infect. Dis. 14, Suppl 1. S148-S153 (1992).
- Sobel, J. D. Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations. Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).
- Song, W. Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17β-estradiol-treated mice. Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).
- Taylor, B. N. In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).
- Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis. Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).
- Tirabassi, R. S. A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2. Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).
- Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis. J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).
- Yano, J. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).
