Summary
We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming in
Abstract
Het probleem van het verwerven van een hoge-resolutie beelden diep in biologische monsters wordt algemeen erkend 1. In lucht gevulde weefsel, zoals de sponsachtige bladmoes van de bladeren van de planten of ongewervelde longen verdere problemen vloeien voort uit verschillende overgangen in brekingsindex tussen de cellulaire componenten, tussen de cellen en luchtruim en tussen de biologisch weefsel en de rest van het optische systeem. Bovendien brekingsindex mismatches leiden tot een verzwakking van de fluorofoor excitatie en signaal emissie in fluorescentie microscopie. We beschrijven hier de toepassing van de perfluorkoolstof, perfluorodecalin (PFD), als een infiltratieve imaging medium die optisch beter laser scanning confocale microscopie (LSCM) monster beeldvorming op diepte, zonder toevlucht te nemen tot beschadiging van stijgingen van de laser kracht en heeft een minimale fysiologische invloed 2. We beschrijven het protocol voor het gebruik van PFD met Arabidopsis thaliana bladweefsel, dat is optisch complex als een gevolg van destructuur (figuur 1). PFD heeft een aantal eigenschappen die het geschikt is voor dit gebruik 3. De brekingsindex van PFD (1.313) is vergelijkbaar met die van water (1.333) en is dichter bij die van cytosol (ca. 1,4) dan de lucht (1.000). Daarnaast, PFD is direct beschikbaar, niet-fluorescerende en is niet giftig. De lage oppervlaktespanning van PFD (19 dynes cm -1) is lager dan die van water (72 dynes cm -1) en ook onder de limiet (25 tot 30 dyne cm -1) voor stomatale penetratie 4, die het mogelijk maakt om overstroming de sponsachtige bladmoes luchtruim zonder toepassing van een potentieel destructieve vacuüm of oppervlakte-actieve stof. Ten slotte, en van cruciaal belang, PFD heeft een grote capaciteit voor het oplossen van CO 2 en O 2, waardoor gasuitwisseling te worden gehandhaafd in het overstroomde weefsel, dus het minimaliseren van de fysiologische impact op het monster. Deze eigenschappen zijn gebruikt in diverse toepassingen waarbij een gedeeltelijke vloeibare ademhaling en longen inflatie onderTIE 5,6, chirurgie 7, 8 kunstmatig bloed, zuurstof van de groeimedia 9, en studies van ijs kristalvorming in planten 10. Op dit moment is het gebruikelijk om weefsel te monteren in water of waterige buffer voor live confocale imaging. Wij zijn van mening dat het gebruik van PFD als een bevestiging medium een verbetering op de bestaande praktijk vertegenwoordigt en laat de eenvoudige bereiding van levende hele blad monsters voor de beeldvorming.
Protocol
Het protocol hieronder gegeven beschrijving van een eenvoudige methode voor het gebruik van PFD als een infiltratieve montage medium in Arabidopsis thaliana bladeren, maar we verwachten dat deze methode kan worden toegepast in een verscheidenheid van toepassingen waar imaging air-rijke weefsel is gewenst.
1. Montage bladmonsters in PFD
- Bereid een microscoop dia met een gas-permeabel pakking van polydimethylsiloxaan (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS is een visco-elastisch polymeer en kan worden gevormd om een kamer aangepast aan experimentele behoeften te bieden.
- PFD evenwicht met lucht. Dit kan worden bereikt door borrelen met lucht of door het schudden van een klein volume van PFD in een met lucht gevulde fles.
- Giet PFD in een open petrischaal en drijven een hele zaailing of weggesneden blad op PFD gedurende 5 minuten. Het weefsel moet worden doorzichtig, doet denken aan verglaasd weefsel (Figuur 2 (a)). Bladeren kunnen donkerder of lichter dan voorheen blootgesteld lijken te PFD, afhankeDing van de lichtomstandigheden en de leeftijd van weefsel gebruikt.
- Vul de PDMS kamer met air-evenwicht PFD en zorgvuldig de weefselmonsters overdracht van de incubatie petrischaal naar de PDMS kamer. Afdichting van de dia met een dekglaasje en beeld volgens de experimentele eisen.
- Let op: PFD ook presteert goed in een open kamer gebouwd op een dekglaasje of in een perfusie kamer en is compatibel met siliconenvet. PFD is niet compatibel met Teflon componenten als het oplost ze.
2. Representatieve resultaten:
Microscopische inspectie van PFD-bebroede bladmonsters blijkt dat de meerderheid van de luchtruim zijn overstroomd. Figuur 2 (b) toont luchtruim overspoeld met recombinant GFP gesuspendeerd in PFD. Het is duidelijk dat het blad wordt overspoeld na incubatie met PFD, maar dat af en toe zakken van de lucht te blijven kunnen. Water is het blad niet vloed onder deze omstandigheden. LSCM van de monsters geïncubeerd en gemonteerd in een ir, water of PFD toont aan dat PFD een voordeel ten opzichte van water en lucht in de diepte van de beeldvorming mogelijk (figuur 3) geeft. Het voorbeeld in Figuur 3 geeft lucht, water en PFD gemonteerd Arabidopsis laat uitdrukken cytosolically gelokaliseerd Venus, een variant van YFP 11 die constitutief wordt uitgedrukt onder de 35S promotor. We zien een ongeveer 2-voudige toename van de diepte van de beeldvorming bij het vergelijken van PFD en water. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat het precieze verbetering gezien bij het gebruik van PFD varieert met de numerieke apertuur van de lens en het type weefsel gebruikt. We hebben gezien cytoplasmatische streaming en wortel haar rek in PFD behandelde zaailingen, elke indicatie van gezonde planten. Daarnaast hebben we laten zien dat de twee Fv / Fm, een maat voor de fotosynthese functioneren van planten 12 blijft binnen aanvaardbare grenzen op tijdschalen gebruikt in de beeldvorming.
3394fig1.jpg "/>
Figuur 1. Plant blad complexiteit en optische implicaties
Schematische voorstelling toont de anatomische kenmerken van de A. thaliana blad ten opzichte van de optische set-up. Gebruikte afkortingen obj. = Objectief, imm. = Onderdompeling vloeistof, cov. = Dekglaasje, mnt. = Inbedmiddel, knippen. = Cuticula, ad. ep. = Adaxial epidermis, st. = Stomatale porie, sp. = Sponsachtige bladmoes, zoals = luchtruim, vriend. = Palissade bladmoes, vb = vasculaire bundel, ad. ep. = Adaxial epidermis. Celwanden worden aangegeven door zwarte lijnen.
Figuur 2. PFD passeert gemakkelijk Arabidopsis bladeren
(A) Leaves geïncubeerd in de lucht, water of PFD voor 5 minuten en beeld gebracht met behulp van een Leica DCF3000FX digitale camera met een Leica MZ16F microscoop (Leica Microsystems (VK) Ltd, Milton Keynes-, Verenigd Koninkrijk). De Jupiter-logo is gedrukt op acetaat film en verlichte weerm beneden met een lichtbak. Belichtingstijd was 89 ms en alle beelden werden verzameld en op identieke wijze verwerkt. Schaal balken geven 2 mm.
(B) PFD uitvoeren gezuiverde recombinante groen fluorescerend eiwit (GFP) begrenst luchtruim in vivo. GFP is vals groen, en rood wordt gebruikt om de chlorofyl fluorescentie-auto, die het bladmoes cellen afbakent laten zien. (Figuur 2 (b) gereproduceerd met toestemming en volledige technische details beschikbaar in Littlejohn et al.. 2010 2). Schaal balken vertegenwoordigen 25 m.
Figuur 3. PFD verbetert de confocale beeldvorming in bladeren
LSCM beelden die cytoplasmically gelokaliseerde Venus fluorescentie (groen) en chlorofyl autofluorescentie (rood) in intacte A. thaliana bladeren afgebeeld in de lucht, water of PFD. Excitatiegolflengte was 514 nm en fluorescentie-emissie werd opgenomen in 518 nm 604 nm voor Venus en bij 657 nm679 nm voor de chloroplasten. Elk paneel is een confocale doorsnede genomen van een Z-stack van 11 confocale beelden die op 5 um intervallen. Deze werden uit een volledige Z-stack van 59 beelden die op een micrometer intervallen, die zijn gebruikt voor de aanvullende films te produceren. Dieptemetingen worden gegeven ten opzichte van de epidermale oppervlak. Representatieve beelden, die identiek zijn verwerkt, worden weergegeven. Experimentele details zoals microscoop instellingen zijn identiek aan die gevonden in Littlejohn et al.., 2010 2. Scalebars vertegenwoordigen 20 urn.
Discussion
Dit is een eenvoudige en makkelijk te gebruiken techniek om microscopie van met lucht gevulde of optisch complexe weefsels te verbeteren. We hebben aangetoond dat de techniek een aantal sterke voordelen heeft en we hopen dat het gebruikt zal worden om biologische vragen met betrekking tot lucht-rijke weefsels toe te lichten. Bijvoorbeeld: het zou een logische keuze voor de studie van pathogene aanval in plant bladmoes of in de longen zijn. We zijn ook bewust van de beperkingen van de techniek. We werken aan een betere brekingsindex matching, gebruik met andere vormen van microscopie, en perfluorkoolstof inbedmiddel replenishment tijdens lange tijdschaal experimenten. We hebben ook wel erkennen dat een van de belangrijkste voordelen van PFK's, namelijk als biologisch inert een keerzijde heeft. PFK's niet gemakkelijk oplossen biologische moleculen, die ook betekent dat ze niet gemakkelijk kan worden gebruikt om de verbindingen van belang, zoals hormonen, drugs, en andere kleine moleculen of ionen te leveren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag aan prof. Nicholas Smirnoff van de Universiteit van Exeter bedanken voor zijn advies en de Universiteit van Exeter BioImaging faciliteit. De financiering werd verstrekt door de Britse biotechnologie en Biologische Wetenschappen Research Council (subsidie referentie BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
