Summary
אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק הדמיה
Abstract
הבעיה של רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה עמוק לתוך דגימות ביולוגיות היא להכרה נרחבת 1. ברקמת אוויר מלא כגון mesophyll הספוגי של עלי הצמח או הריאות חוליות קשיים נוספים נובעים מעברים מרובים מקדם השבירה בין מרכיבים תאיים, בין התאים airspaces ובין הרקמה הביולוגית ואת שאר מערכת אופטית. יתר על כן, חוסר התאמה מקדם השבירה להוביל הנחתה של עירור ופליטה fluorophore האות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו מתארים כאן את היישום של perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), כאמצעי הדמיה אופטית infiltrative אשר משפר לייזר מיקרוסקופיית confocal (LSCM) הדמיה מדגם בעומק, מבלי להזדקק מגביר פגיעה בשלטון לייזר ויש לו השפעה פיזיולוגית מינימלית 2. אנו מתארים את הפרוטוקול לשימוש PFD עם רקמת עלה ארבידופסיס thaliana, אשר מורכב אופטית כתוצאה שלהמבנה (איור 1). PFD יש מספר תכונות שהופכות אותו מתאים לשימוש הזה 3. מקדם השבירה של PFD (1.313) דומה לזו של מים (1.333), והוא קרוב יותר לזה של cytosol (כ 1.4) מאשר אוויר (1.000). בנוסף, PFD זמינה, ללא ניאון אינו רעיל. מתח הפנים הנמוך של PFD (19 dynes -1 ס"מ), נמוכה מזו של מים (72 dynes -1 ס"מ) וגם מתחת לגבול (25-30 ס"מ Dyne -1) עבור חדירה הפיוניות 4, המאפשר לה להציף mesophyll airspaces ספוגי ללא יישום של ואקום פוטנציאל הרסני או פעילי שטח. לבסוף ו מכריע, PFD בעל קיבולת גדולה המסת CO 2 ו-O 2, אשר מאפשר חילופי גזים להישמר ברקמה מוצף, ובכך ממזערת את ההשפעה הפיזיולוגית על המדגם. מאפיינים אלה היו בשימוש ביישומים שונים הכוללים נשימה נוזלי חלקי הריאות inflation 5,6, 7 ניתוחים, דם מלאכותי 8, חמצון של צמיחה מדיה 9, ומחקרים של היווצרות קרח קריסטל בצמחים 10. כיום, מקובל לעלות רקמות במים או חיץ מימית הדמיה confocal לחיות. אנו רואים כי השימוש PFD כמדיום הרכבה מהווה שיפור על הנוהג הקיים ומאפשרת הכנת פשוט לחיות דגימות עלים שלמים הדמיה.
Protocol
פרוטוקול כדלקמן מתאר שיטה פשוטה לשימוש PFD כמדיום הרכבה infiltrative בעלים thaliana ארבידופסיס, אך אנו צופים כי בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים בהם הדמיה אוויר עשיר ברקמות הוא הרצוי.
1. עלה דגימות הרכבה ב PFD
- הכינו שקופית מיקרוסקופ עם אטם גז חדיר של polydimethylsiloxane (PDMS, ג'ל קרוליינה תצפית). PDMS הוא פולימר viscoelastic והוא יכול להיות מעוצב על מנת לספק קאמרית המותאמים לדרישות הניסוי.
- לאזן PFD עם האוויר. זו יכולה להיות מושגת על ידי מבעבע עם אוויר או על ידי רעד נפח קטן של PFD בבקבוק אוויר מלא.
- PFD למזוג לתוך צלחת פטרי פתוחה לצוף שתיל כולו או עלה נכרת על PFD במשך 5 דקות. הרקמה צריך להיות שקוף, המזכירים רקמות מזוגגת (איור 2 (א)). עלים עשוי להופיע כהה או בהיר יותר מאשר לפני החשיפה PFD, depenדינג על תנאי תאורה לגיל רקמות בשימוש.
- מלאו את תא PDMS עם PFD אוויר equilibrated ובזהירות להעביר את דגימות רקמה מן צלחת פטרי הדגירה לחדר PDMS. חותם את השקופית עם coverslip ותמונה על פי דרישות הניסוי.
- הערה: PFD גם מתפקדת היטב בתא פתוח בנוי על coverslip או בתא זלוף והוא תואם עם גריז סיליקון. PFD אינו תואם טפלון רכיבים כמו מתמוסס להם.
2. נציג תוצאות:
בדיקה מיקרוסקופית של PFD-מודגרות דגימות עלים מראה כי הרוב המכריע של airspaces מוצפים. איור 2 (ב) מראה airspaces מוצף GFP רקומביננטי תלויה PFD. ניכר כי עלה מוצף על הדגירה עם PFD, אך פה ושם כיסי אוויר עשויים להישאר. מים לא להציף את עלה בתנאים אלה. LSCM של דגימות מודגרות ועלה ב ir, מים או מראה כי PFD PFD נותן יתרון על פני מים ואוויר לעומק של הדמיה אפשרי (איור 3). הדוגמה שניתנה איור 3 מראה, אוויר ומים PFD ארבידופסיס רכוב עלי להביע את ונוס מקומי cytosolically, סוג של YFP 11 כי הוא הביע constitutively תחת האמרגן 35S. אנו יכולים לראות גידול של פי 2 בקירוב לעומק של הדמיה כאשר משווים PFD ומים. יצוין, עם זאת, כי השיפור מדויק לראות בעת שימוש PFD משתנה עם צמצם המספרי של העדשה ואת סוג של רקמה בשימוש. ראינו נהירה cytoplasmic ושיער התארכות שורש שתילים שטופלו PFD, שכל אחד מהם מעיד על צמחים בריאים. בנוסף הראינו כי 2 Fv / Fm, מידה מסוימת של תפקוד הפוטוסינתזה של צמחים 12 נשאר בגבולות נסבלים על לוחות הזמנים בשימוש בתחום ההדמיה.
3394fig1.jpg "/>
באיור 1. עלה הצמח המורכבות ואת ההשלכות אופטי
ייצוג Diagrammatical מראה את תכונות אנטומיות של א ' thaliana עלה ביחס אופטי הגדרת. קיצורים בהם נעשה שימוש הם obj. = המטרה העדשה, IMM. = נוזל טבילה, Cov. = Coverslip, mnt. = Mountant, לחתוך. = לציפורן, המודעה. EP. = האפידרמיס adaxial, st. = נקבובית הפיוניות, SP. = Mesophyll ספוגי, כפי = חלל האוויר, חבר. = Mesophyll משוכה, vb = חבילה של כלי הדם, המודעה. EP. = Adaxial האפידרמיס. קירות התא מסומנים על ידי קווים שחורים.
באיור 2. PFD חודר בקלות עלים ארבידופסיס
(א) עלים מודגרות באוויר, במים או PFD במשך 5 דקות, צילמו במצלמה דיגיטלית DCF3000FX לייקה עם מיקרוסקופ הלייקה MZ16F (Leica Microsystems (בריטניה) בע"מ, מילטון קיינס, אנגליה). הלוגו יופיטר היה מודפס על הסרט אצטט והאירו הלוך ושובמ 'מתחת עם תיבת אור. זמן חשיפה היה 89 ms וכל התמונות נאספו ועובדו זהה. ברים סולם מייצגים 2 מ"מ.
(ב) PFD נושאת מטוהרים רקומביננטי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) התוחם airspaces in vivo. ה-GFP הוא בצבע ירוק שווא, אדום משמש להראות כלורופיל אוטומטי הקרינה, אשר התוחם את התאים mesophyll. (איור 2 (ב) רשות לשכפל עם פרטים טכניים מלאים זמינים Littlejohn et al. 2010 2). ברים סולם מייצגים 25 מ '
באיור 3. PFD משפר הדמיה confocal בעלים
תמונות LSCM מראה מקומי cytoplasmically ונוס פלואורסצנטי (ירוק) ו autofluorescence כלורופיל (אדום) ב thaliana א עלים שלמים צילמו באוויר, במים או PFD. גל עירור היה 514 ננומטר פליטת הקרינה נרשמה ננומטר 518 604 ננומטר עבור ונוס ב 657 ננומטר679 ננומטר עבור כלורופלסטים. פאנל כל קטע confocal יחיד שנלקח מחסנית-Z של 11 תמונות confocal רכשה ב 5 מרווחי מיקרומטר. אלה היו מופק ערימה-Z מלא של 59 תמונות שנרכשו ב 1 במרווחים מיקרומטר, אשר שימשו להפקת סרטים משלים. מדידות עומק מקבלים יחסית אל פני השטח אפידרמיס. תמונות הנציג, אשר עובדו זהה, מוצגים. פרטים ניסויית כגון הגדרות מיקרוסקופ זהים לאלה שנמצאו Littlejohn et al. 2010 2. Scalebars מייצגים 20 מיקרומטר.
Discussion
זוהי טכניקה פשוטה וקלה לשימוש כדי לשפר את מיקרוסקופית של אוויר מלא או אופטית רקמות מורכבות. הראינו כי הטכניקה יש כמה יתרונות חזקים ואנו מקווים כי הוא ישמש להבהיר שאלות ביולוגיות הנוגעות אוויר עשיר רקמות. לדוגמה זה יהיה בחירה טבעית עבור מחקרים של ההתקפה הפתוגן ב mesophyll צמח או הריאות. אנו גם מודעים למגבלות של הטכניקה. אנחנו עובדים על התאמה טובה יותר מקדם השבירה, לשימוש עם מצבים אחרים של מיקרוסקופיה, ומילוי perfluorocarbon mountant במהלך הניסויים זמנים ארוכים. אנו גם מכירים, עם זאת, כי אחד היתרונות העיקריים של PFCs, כלומר להיות אינרטי מבחינה ביולוגית יש flipside. PFCs אינם מתמוססים בקלות מולקולות ביולוגיות אשר גם מרמז כי הם אינם יכולים לשמש בקלות לספק תרכובות של עניין, כגון הורמונים, תרופות מולקולות קטנות או יונים אחרים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות פרופ 'ניקולס סמירנוף מאוניברסיטת אקסטר את עצתו של אוניברסיטת אקסטר מתקן bioimaging. המימון ניתן על ידי בריטניה ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (מענק התייחסות BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
