Summary
Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando o
Abstract
O sistema nervoso central podem experimentar uma série de tensões e traumas neurológicos, que podem ter vários efeitos adversos que acabará por levar a uma redução da população neuronal e função. Axônios danificado pode liberar moléculas excitatório glutamato, incluindo potássio, ou na matriz extracelular, que por sua vez, pode produzir mais insulto e prejuízo para as células da glia de apoio, incluindo astrócitos e oligodendrócitos 8, 16. Se o insulto persistir, as células sofrem morte celular programada (apoptose), que é regulado e ativado por um número de bem estabelecida cascatas de transdução de sinal 14. Apoptose e necrose do tecido pode ocorrer após lesão cerebral traumática, isquemia cerebral e convulsões. Um exemplo clássico de regulação por apoptose é a família de cisteína-dependente aspartato-proteases dirigidas, ou caspases. Proteases ativadas, incluindo caspases também têm sido implicados na morte celular em resposta a neuro crônicadoenças degenerativas incluindo Alzheimer, Huntington, esclerose múltipla e 4, 14, 3, 11, 7.
Neste protocolo, descrevemos o uso do 488 NucView substrato caspase-3 para medir a taxa de apoptose caspase-3 mediada em imortalizado N19-oligodendrócitos culturas (OLG) celular 15, 5, após a exposição a diferentes tensões extracelular, tais como altas concentrações de potássio ou glutamato. A linhagem celular imortalizada condicionalmente-N19-OLG (representando o progenitor O2A) foi obtido de Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, e tem sido utilizado anteriormente para estudar os mecanismos moleculares de mielina expressão gênica e transdução de sinal de liderança OLG a diferenciação (por exemplo, 6, 10). Nós encontramos essa linha de células para ser robusto com respeito a transfecção com exógenos proteína básica de mielina (MBP) constrói soldados a qualquer RFP ou GFP (vermelho ou verde proteína fluorescente) 13,12. Aqui, as culturas celulares N19-OLG foram tratados com cloreto de potássio 80 mM glutamato de sódio ou 100 mM para imitar vazamento axonal na matriz extracelular para induzir a apoptose 9. Usamos um bi-funcionais substrato caspase-3 contendo uma DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 subunidade reconhecimento e um corante DNA-binding 2. O substrato rapidamente entra no citoplasma onde é clivado pela intracelular caspase-3. O corante, NucView 488 é liberado e entra no núcleo da célula onde se liga DNA e fluoresce verde a 488 nm, sinalizando apoptose. Uso do 488 caspase-3 NucView substrato permite viver de células de imagem em tempo real 1, 10. Neste vídeo, nós também descrever a cultura e transfecção de células imortalizadas N19-OLG, bem como técnicas de live-célula de imagem.
Protocol
1. Descongelamento e cultura de células
- Obtenção de estoque de congelados imortalizado N19-oligodendroglial células do tempo de armazenamento de nitrogênio líquido termo.
- Frasco contendo células mergulhar a 37 ° C banho-maria até que a suspensão celular é completamente descongelado.
- Adicionar 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado de Médio Eagle) com glicose alta suplementado com 10% FBS (soro fetal bovino) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma placa de cultura de 10 cm.
- Adicione o celular suspensão gota a gota, à placa, e agite suavemente e rock a placa de Petri para dispersar as células uniformemente.
- Células de cultura a 34 ° C / 5% da incubadora de CO 2.
- Após 4 horas, media aspirado de placas para remover qualquer DMSO restante (dimetilsulfóxido), que tinha sido usado como crioprotetor, e substituir por novas mídias (7 mL DMEM alta glicose meio suplementado com 10% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina) .
2. Células Passaging
- Em 70-80%confluência (4-7 dias de crescimento), aspirado de mídia a partir de células.
- Adicionar 1 mL de tripsina 0,25% ao prato. Pipeta de tripsina para separar células (cerca de 5 minutos).
- Faça as diluições apropriadas para as condições experimentais e passagem de uma placa adicional de 10 centímetros para futuros experimentos com uma densidade de células não menos que 0,1 x 10 6 células / ml.
Nota: Você deve passar suas células pelo menos duas vezes após o descongelamento antes de usá-los para experiências.
3. Contagem e cultivo de células
- Às células placa de live-célula de imagem, trypsinize como descrito anteriormente.
- Remover cerca de 30 mL de células e contagem usando um hemocitómetro.
- Coloque uma lamela de vidro sem revestimento em uma placa de 6 bem. Adicionar células para o bem, a uma densidade de 0,1 x 10 6 células / mL em 2 mL de fenol livre de DMEM alta glicose mídia, suplementado com 10% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina, em 34 ° C / 5% CO 2.
- Permitircélulas a crescer durante a noite (16-20 h) em 34 ° C / 5% CO 2 antes de transfecção.
4. Transfecção
- Combine 100 L de soro de mídia livre, 0,5-4 mg DNA plasmidial purificado e 4 mL FuGENE HD (Roche). Vortex cuidadosamente para misturar.
- Vortex novo brevemente e permitir que o DNA ao complexo por 5 min à temperatura ambiente, e depois adicionar FuGENE mistura DNA HD diretamente para as células em cultura. Incline a placa delicadamente para misturar.
- Cultura as células para um adicional de 48 h em 34 ° C / 5% CO 2 antes do tratamento ou experimentação.
5. Células preparando para o Live-Cell Imaging (LCI)
- Ligue o Chamlide LCI caixa de controle ao vivo de células instrumento, pelo menos, 1 h antes que você queira iniciar o seu experimento. A caixa de controle também regula a temperatura ea umidade dentro do Chamlide LCI, e regula o fluxo do pré-misturados 5% CO 2.
Nota: É aconselhávelligar a caixa de controle até 3 h antes dos experimentos início para garantir que todo o palco atinge 34 ° C. Esta etapa irá reduzir a deriva focal, que é causada por fluxulation e expansão térmica da fase de metal como se aquece, durante o exame.
- Trabalhando em um fluxo-capa, spray na câmara de cultura Chamlide magnético do tipo, e uma pinça, com etanol 70% e deixe secar por 5 minutos.
- Remover as células da incubadora e confirmar que eles são saudáveis. Eles devem aparecer aderente e bem espalhado sobre a lamínula de vidro com processos de membrana numerosos. Células que estão estressados de transfecção não são adequados para a experimentação, e terá um número reduzido de extensões de processos, e muitas vezes têm um núcleo de formato irregular.
- Incline a placa 6-bem e retire a lamela com pinça. Rapidamente coloque o lado célula lamínula para cima no tabuleiro inferior da câmara de cultura. Não permita que a lamela para secar.
- Anexar o magnético principalcorpo da câmara de cultura e adicionar 500 mL de mídia a partir da placa 6-bem original para o topo da lamela. Re-utilizar esta mídia vai diminuir a quantidade de estresse colocado sobre as células causados por mudanças ambientais, e também pode ser útil para avaliar extracelular fatores secretados.
- Coloque a tampa de vidro na câmara de cultura.
- Use uma KimWipe pulverizadas com etanol 70% para remover qualquer material residual do fundo da lamela, o que interfere com a microscopia.
- Coloque a câmara de cultura nos 34 ° C / 5% incubadora de CO 2 por 30 min. Esta etapa irá assegurar que a câmara se aquece a 34 ° C para reduzir o deslocamento da lamínula como o metal se aquece.
6. Configurações de microscópio
Imagens foram adquiridas aqui, usando um microscópio Leica DMIRE2 invertido com uma lente relay personalizado e habitação de emissão roda de filtros de cartucho de carregamento de rodas múltiplas (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON).
- Brightfield - Lâmpada para 2,5 V e tempo de exposição a 240 ms.
- Red Fluorescent Protein (RFP) - Ganho fixado em 140 para 200 ms.
- Proteína Verde Fluorescente (GFP) - Ganho fixado em 140 para 500 ms.
- Nosso microscópio tem uma lâmpada regulável em vez de um disco de fiação para controlar a quantidade de luz disponível para as células. Corremos nossos experimentos com a luz em 90% da intensidade máxima da lâmpada.
7. Tratamento das células com indutores da apoptose e 488 NucView Caspase-3 de substrato
- É importante preparar grandes estoques de indutores de apoptose antes do tempo e congelá-los em alíquotas, de modo que as concentrações será consistente entre experimentos.
- O NucView 488 substrato é sensível à luz. Preparar alíquotas de 15 mL para reduzir tubos de congelamento / descongelamento, e armazenar a -20 ° C coberto com papel alumínio. Trabalhar com a iluminação da sala ambiente tão baixa quanto possível para reduzir a exposição do NucVsubstrato iew 488 à luz, antes da sua utilização.
- Recuperar a câmara de cultura rapidamente da incubadora para que as células não estão expostos a uma redução na temperatura. Coloque a câmara de cultura para a câmara ambiental do microscópio, e usar grampos para manter a câmara de cultura de movimento. Neste ponto, você também deve dim as luzes da sala.
- Ligue o pré-misturados 5% de CO 2 tanque com regulador dual.
- Usando a objetiva de 10x, foco para encontrar células no monitor do computador usando microscopia de campo brilhante. Nota: você gostaria de usar a maior abertura numérica no objectivo com a ampliação desejada para reduzir o tempo de exposição.
- Entregar indutores de apoptose das células (no nosso caso 80 mM de potássio, glutamato ou 100 mM), um dos seguintes métodos podem ser usados. Nós usaremos a entrega de 80 mM de potássio como um exemplo, utilizando KCl dissolvido como um concentrado 10x no nosso meio de cultura típica.
- Media Exchange by perfusão lenta e local:
- Use uma bomba peristáltica para a mídia de troca na câmara de cultura com novas mídias contendo 80 mM de potássio.
- Uma final da tubulação vai entregar 10 mL de um estoque de 80 mM de potássio dissolvido em DMEM livre de fenol, ea outra extremidade do tubo irá remover a mídia da câmara.
- Você quer trocar um pelo menos 10x de mídia para garantir que o material deixado na câmara tem a concentração correta de potássio.
- Depois de mídia é trocado, adicionar 3 mL de substrato NucView 488 para a mídia na câmara. Pipeta para misturar. - Adição direta de 80 mM K + e NucView 488 substrato para a mídia na câmara de cultura:
- Prepare uma solução estoque de 10x de 80 mM de potássio dissolvido em DMEM livre de fenol.
- Adicionar 3 mL de substrato NucView 488-50 mL de potássio mM 10x 80. Pipeta para misturar. Adicionar a 500 mL de fenol livre de DMEM em câmara de cultura.
Nota: este método épreferida se você estiver interessado em manter ou avaliação do crescimento ou outros fatores secretados que podem estar presentes na mídia original. Nós descobrimos que o 488 NucView substrato é estável em cultura de células para experimentos com duração até 36 h.
- Media Exchange by perfusão lenta e local:
8. Live-célula de imagem
- Clique no canal vermelho para mostrar células transfectadas.
- Selecionar e salvar em torno de uma dúzia de quadros onde há várias células transfectadas, e salvar estes "pontos estágio XY". Dependendo da quantidade de memória de computador, você pode ser limitado ao número de pontos de estágio que você será capaz de adquirir.
- Ter as imagens de microscópio de captura (em brilhante campo canal, vermelho, e canal verde) nestes estágios salvos pontos a cada 6 minutos.
- Qualquer coloração verde que é visível durante as fases iniciais dos experimentos provavelmente indica células que já estão em apoptose, devido normalmente a transfecção e / ou estresse ambiental. Apoptosis devido a tratamentos experimentais serão detectados em um ponto no tempo no final do experimento.
9. Análise estatística
Para cada experimento, o programa de microscópio para adquirir pontos XY múltiplos para reunir um grande conjunto de dados de forma eficiente. Cada experimento é realizado em duplicata ou triplicata, e os dados são compilados a partir de experiências separadas realizadas em dias diferentes. De cada conjunto de dados, analisamos até 15 campos de ver e comparar a proporção de células caspase-negativos para caspase-células positivas (número total de células no campo de visão / número total de caspase-células positivas).
- As medições gravadas de cada conjunto de dados são agrupados em um conjunto amostra maior, e depois são comparados entre si utilizando uma tabela ANOVA (p = 0,05). Nós mostramos os erros padrão da média (SEM) de cada experimento, e então comparar a diferença de meios através da realização de um teste de Tukey comparação das médias (p = 0,05) para determinar which tratamentos são significativamente diferentes umas das outras.
10. Resultados representante
Nós descrevemos um experimento para ilustrar como o NucView 488 substrato pode indicar um aumento da taxa de apoptose de N19-OLG culturas de células após um tratamento com uma alta concentração de potássio extracelular. O N19-células foram transfectadas com RFP, e eram tratadas com 3 mL NucView 488 substrato (controle), ou 3 mL NucView 488 substrato e 80 mM [K +] (o tratamento). As células foram monitorados e as imagens foram adquiridas ao longo de um curso de tempo 12 h, que é adequado para estudos envolvendo insultos neurológicos (Figura 1A). Em condições de controle, não foram observadas quantidades significativas de apoptose em relação ao 80 mM [K +] culturas tratadas (caixa de hash), que apresentou cerca de 45% de morte celular após 12 h (Figura 1B). O sinal de fundo verde observard nas condições de controle indica as células que estão apoptose sem a adição de potássio extracelular. Praticamente nenhuma das células no controle de apoptose exibem experimentar o ponto de tempo de 12 h, embora em outras situações os experimentos podem ser obrigados a longo prazo. As imagens foram adquiridas usando uma objetiva de 10x. Bar = 100 mm.
Figura 1. (A) A 12 h experimento tempo de curso do N19 culturas OLG 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho), juntamente com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde). Culturas eram tratados com uma concentração final de 80 mM [K +] (painéis à esquerda), ou nenhum tratamento como controle (painéis à direita). Imagens foram obtidas em intervalos de 6 min e ativação significativa da caspase-3 (sinal verde) pode ser observard em culturas tratadas com 80 mM [K +] dentro do núcleo das células (caixa de hash) em comparação com o experimento de controle. (B) Percentagem de caspase-3 células (calculado pela divisão do número total de células no campo de visão por o número total de caspase-células positivas). Em comparação com condições de controle, observou-se em torno de 45% a morte das células seguintes K +-tratamento por 12 h.
SVideo 1. A 12 h experimento tempo de curso do N19-OLG culturas 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho) com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde), juntamente com brilhante-campo e imagens de uma forma de três imagem fundida, após o tratamento com 80 mM [K +].
SVideo 2. A 12 h experimento tempo de curso do N19-OLG culturas 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho) com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde), juntamente com brilhante-campo images e uma imagem de três vias mescladas. Nenhum tratamento foi aplicado para as culturas e N19-OLGs pode ser visto através da migração campo do microscópio em contraste com a cultura de células tratadas com 80 mM [K +] (compare com SVideo 1).
Discussion
Embora este não é o único produto fluorogênico disponíveis para a detecção de apoptose, existem várias vantagens significativas para usar o NucView 488 substrato. Um dos principais benefícios é a capacidade de acompanhar a apoptose em células vivas em tempo real, enquanto a maioria dos produtos alternativos, ou requerer a lise celular ou ter permeabilidade celular pobres. Outros benefícios incluem a alta sensibilidade para caspase-3, o reconhecimento de alta permeabilidade celular, baixa citotoxicidade, e nenhuma interferência com a progressão da apoptose. O substrato também tem fluorescência de fundo baixo até que ele é clivado e entra no núcleo, o que elimina fluorescência de fundo. A seqüência de caspase-3 reconhecimento contém 3 cargas negativas e o corante DNA-binding tem uma carga positiva 2. O DEVD-NucView 488 molécula, portanto, tem uma carga líquida negativa, o que impede a ativação e ligação do corante ao DNA em células caspase onde não está ativo.
Maintaining consistência entre experimentos é necessário para ser capaz de estabelecer comparações significativas entre repetições. Um dos principais parâmetros para manter consistente é a densidade de células, como ela afeta a taxa de transfecção. Obtenção de taxas de transfecção alta em imortalizado N19-OLG culturas de células é mais difícil do que com outras linhagens de células comuns, tais como HeLa ou HEK293, e é altamente dependente de densidade, em nossa experiência 12, 13. Nossos melhores eficiências de transfecção para estas células têm sido obtidos com Fugene HD (Roche) e são normalmente cerca de 15%, mas pode chegar a mais de 30%, dependendo da construção. Contagem de células cuidado ajudará na obtenção de taxas de transfecção consistente. Também é importante para expor as células de diferentes tratamentos para o mesmo grau de estresse ambiental, particularmente quando se mede as taxas de apoptose. Especificamente, o comprimento de tempo durante o qual as células são expostas a reagentes de transfecção, ou a quantidade de exposição à luz, são importantes variáveis ambientaisveis a considerar, e deve permanecer constante em experimentos. Para nossas aplicações, descobrimos que a recolha de um grande número de campos de visão fornece uma amostra suficientemente grande para fazer comparações estatisticamente significativa [Ibidem].
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Este laboratório tem sido apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada, e da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá (MSSC). GSTs foi o destinatário de uma Studentship Doutorado da MSSC. Somos gratos a Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) para muitas discussões úteis e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos a Biotium por sua generosa oferta de NucView adicionais 488 caspase-3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium, Inc. | 30029 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Roche Group | 04709705001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO, by Life Technologies | 31053-028 | |
| 0.25% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 15050-065 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 12483-020 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| #1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 | |
Chamlide CMB magnetic culture chamber for 25 mm coverslip |
Quorum Technologies | CM-B-40 | |
| Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR international | 82050-576 | |
| BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR international | CA62406-161 | |
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