Summary
Live-cell imaging av caspase-3 medierad apoptos i förevigat N19-oligodendrocyte cellkulturer med
Abstract
Det centrala nervsystemet kan uppleva ett antal av spänningar och neurologiska förolämpningar, vilket kan ha många negativa effekter som i slutändan leda till en minskning i neuronala befolkningen och funktion. Skadade axoner kan släppa excitatoriska molekyler inklusive kalium eller glutamat i den extracellulära matrisen, vilket i sin tur kan ge ytterligare förolämpning och skada för att stödja gliaceller inklusive astrocyter och oligodendrocyter 8, 16. Om förolämpning kvarstår kommer celler genomgår programmerad celldöd (apoptos), som regleras och aktiveras av ett antal väl etablerade kaskader signaltransduktion 14. Apoptos och vävnadsnekros kan inträffa efter traumatisk hjärnskada, cerebral ischemi, och kramper. Ett klassiskt exempel på apoptotiska reglering är familjen av cystein-beroende aspartat riktad-proteaser, eller kaspaser. Aktiverade proteaser, inklusive kaspaser har också varit inblandad i celldöd som svar på kroniska neurodegenerativa sjukdomar inklusive Alzheimers, Huntingtons och multipel skleros 4, 14, 3, 11, 7.
I detta protokoll beskriver vi användandet av NucView 488 caspase-3 substrat för att mäta graden av caspase-3 medierad apoptos i förevigat N19-oligodendrocyte (OLG) cellkulturer 15, 5, efter exponering för olika extracellulära stress, såsom höga koncentrationer av kalium eller glutamat. De villkorligt-förevigat N19-OLG cellinje (som representerar O2A stamceller) har erhållits från Dr Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, och har tidigare använts för att studera molekylära mekanismer av myelin genuttryck och signaltransduktion ledande till OLG differentiering (t.ex. 6, 10). Vi har funnit denna cellinje vara robust med avseende på transfektion med exogena myelin grundläggande protein (MBP) konstruktioner smält till antingen RFP eller GFP (rött eller grönt fluorescerande protein) 13,12. Här var N19-OLG cellkulturer som behandlades med antingen 80 mm kaliumklorid eller 100 mm Natriumglutamat för att efterlikna axonal läckage i den extracellulära matrisen att inducera apoptos 9. Vi använde en bi-funktionellt caspase-3 substrat som innehåller en DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 erkännande subenheten och ett DNA-bindande färg 2. Underlaget går snabbt cytoplasman där det klyvs av intracellulära caspase-3. Färgen, NucView 488 frigörs och går in i cellkärnan där den binder DNA och fluorescerar i grönt vid 488 nm, signalering apoptos. Användning av NucView 488 caspase-3 substrat möjliggör live-cell imaging i realtid 1, 10. I denna video beskriver vi även odling och transfektion av förevigat N19-OLG celler, samt live-cell avbildningstekniker.
Protocol
1. Upptining och celler Odling
- Skaffa lager av frysta förevigat N19-oligodendroglial celler från långsiktiga butiker flytande kväve.
- Sänk injektionsflaska innehåller celler vid 37 ° C vattenbad tills cellsuspension är helt upptinad.
- Tillsätt 7 mL DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) med hög-glukos kompletterad med 10% FBS (Fetalt bovint serum) och 1% penicillin / streptomycin till en 10 cm kultur plattan.
- Lägg till cell-fjädring droppvis till plattan, och försiktigt skaka och rock till Petri plattan för att skingra de celler jämnt.
- Kultur celler vid 34 ° C / 5% CO 2 inkubator.
- Efter 4 timmar, aspirera media från tallrikar att undanröja eventuella återstående DMSO (dimetylsulfoxid) som hade använts som ett frysskyddsmedel, och ersätta med nya medier (7 ml DMEM hög glukos media kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin) .
2. Passaging Celler
- Vid 70-80%sammanflödet (4-7 dagar tillväxt), aspirera media från celler.
- Tillsätt 1 mL 0,25% trypsin till tallrik. Pipettera Trypsin att lossa celler (ca 5 minuter).
- Gör lämpliga spädningar för experimentella förhållanden och passage ytterligare 10 cm plåt för framtida experiment på en celltäthet inte mindre än 0,1 x 10 6 celler / ml.
Observera: Du bör passage dina celler minst två gånger efter upptining innan du använder dem för experiment.
3. Räkning och Plating celler
- Till tallrik celler för live-cell imaging, trypsinize som tidigare beskrivits.
- Ta bort ca 30 mikroliter av celler och räkna med en haemocytometer.
- Placera ett obestruket glas täckglas i 6 brunnar. Lägg celler till brunnen vid en densitet av 0,1 x 10 6 celler / ml i 2 ml fenol-fri DMEM hög-glukos media, kompletterad med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin, vid 34 ° C / 5% CO 2.
- Tillåtcellerna att växa över natten (16-20 timmar) vid 34 ° C / 5% CO 2 innan transfektion.
4. Transfektion
- Kombinera 100 mikroliter serum-fria medier, 0,5-4 mikrogram renat plasmid-DNA, och 4 mikroliter FuGENE HD (Roche). Vortex försiktigt för att blanda.
- Vortex igen en kort stund och låta DNA till komplexa i 5 min i rumstemperatur och sedan lägga FuGENE HD DNA-blandningen direkt på odlade celler. Luta plattan försiktigt för att blanda.
- Kultur cellerna i ytterligare 48 timmar vid 34 ° C / 5% CO 2 före behandling eller experiment.
5. Förbereda Celler för live-cell imaging (LCI)
- Slå på LCI Chamlide live-cell instrument kontrollboxen minst 1 timme innan du vill starta experimentet. Kontrollboxen reglerar också temperatur och luftfuktighet i arbetskostnadsindex Chamlide, och reglerar flödet av förblandade 5% CO 2.
OBS: Det är lämpligt attslå på kontrollboxen upp till 3 timmar innan experiment för att säkerställa att hela scenen når 34 ° C. Detta steg kommer att minska fokus avdrift, som orsakas av fluxulation och termisk expansion av metall scenen som den värms under avbildning.
- Att arbeta i ett flödes-huva, spraya Chamlide magnetiska typ kultur kammare och pincett, med 70% etanol och låt dem torka i 5 minuter.
- Ta bort celler från inkubator och bekräftar att de är friska. De bör finnas vidhäftande och väl spritt på glaset täckglas med många membran processer. Celler som är stressade från transfektion är inte lämpliga för experiment, och kommer att ha ett reducerat antal processen förlängningar, och har ofta en oregelbundet formad kärna.
- Luta 6-brunnar och ta bort täckglas med pincett. Placera snabbt sidan täckglas cell upp i bottenplattan av kulturen kammaren. Låt inte täckglas torka.
- Fäst den magnetiska huvudsakligakropp av kulturen kammaren och lägger till 500 mikroliter av media från de ursprungliga 6-brunnar på toppen av täckglas. Återanvända detta medium kommer att minska mängden stress placeras på celler orsakade av miljöförändringar, och kan också vara användbart för att bedöma extracellulära utsöndras faktorer.
- Placera skyddsglaset på kulturen kammaren.
- Använd en KimWipe besprutas med 70% etanol att ta bort eventuella material från botten av täckglas, vilket skulle störa mikroskopi.
- Placera kulturen kammare i 34 ° C / 5% CO 2 inkubator i 30 min. Detta steg kommer att säkerställa att kammaren i sig värms till 34 ° C för att minska förskjutning av täckglas som metall värms upp.
6. Mikroskop Inställningar
Bilder förvärvades här med en Leica DMIRE2 inverterat mikroskop med en egen relä objektiv och utsläpp filter hjulhuset för patron lastning av flera hjul (kvorum Technologies Inc., Guelph, ON).
- Brightfield - Lampan satt till 2,5 V och exponeringstid till 240 ms.
- Röd fluorescerande protein (RFP) - Få inställd på 140 för 200 ms.
- Grönt fluorescerande protein (GFP) - Gain satt till 140 för 500 ms.
- Vår mikroskop har en dimbar lampa istället för en snurrande skiva för att kontrollera mängden ljus tillgänglig för cellerna. Vi driver våra experiment med ljus i 90% av maximal lampans intensitet.
7. Behandling av celler med apoptosframkallande medel och NucView 488 caspase-3 substrat
- Det är viktigt att förbereda sig stora lager av apoptos-inducerare i förväg och frysa dem i portioner, så att halterna kommer att vara konsekvent mellan experiment.
- Den NucView 488 substrat är ljuskänsligt. Förbered alikvoter av 15 mikroliter för att minska frysa / tina, och förvara rören vid -20 ° C täckt av aluminiumfolie. Arbeta med den omgivande belysningen i rummet så låg som möjligt för att minska exponeringen av NucVIEW 488 substrat för ljus, före dess användning.
- Hämta den kultur kammaren snabbt från inkubatorn så att cellerna inte utsätts för en minskning av temperaturen. Placera kultur kammaren på klimatkammare av mikroskopet och använda klämmor för att hålla kulturen kammaren från att flytta. Vid det här laget bör du också dämpa rummet ljus.
- Slå på förblandade 5% CO 2 tank med dubbla regulator.
- Med hjälp av 10x mål, fokus att hitta celler på datorskärmen med hjälp av ljus-fält mikroskop. OBS: du skulle vilja använda den största numeriska bländaröppningen på syftet med önskad förstoring för att minska exponeringstiden.
- Leverera inducerare av apoptos i celler (i vårt fall 80 mm kalium, eller 100 mm glutamat), kan en av följande metoder användas. Vi kommer att använda leverans av 80 mm kalium som ett exempel, med KCl upplöst som 10x koncentrat i vårt typiska kultur media.
- Media utbyte By långsam och lokal perfusion:
- Använd en Slangpumpar att byta media i kulturen kammare med nya medier som innehåller 80 mm kalium.
- Ena änden av slangen kommer att leverera 10 ml av en lager av 80 mm kalium löst i fenol-fri DMEM, och den andra änden av slangen kommer att ta bort materialet från kammaren.
- Du vill ha minst en 10x utbyte av media för att se till att medierna kvar i kammaren har rätt koncentration av kalium.
- Efter medier byts ut, tillsätt 3 mikroliter av NucView 488 substrat till media i kammaren. Pipettera att blanda. - Direkt tillsats av 80 mm K + och NucView 488 substrat till medier i kultur kammare:
- Utarbeta ett 10x stamlösning på 80 mm kalium löst i fenol-fri DMEM.
- Tillsätt 3 mikroliter av NucView 488 substrat till 50 mikroliter av 10x 80 mm kalium. Pipettera att blanda. Lägg till 500 mikroliter fenol-fri DMEM i kultur kammare.
Notera: Denna metod ärföredra om du är intresserad av att bibehålla eller att bedöma tillväxt eller andra utsöndrade faktorer som kan finnas i den ursprungliga media. Vi har funnit att NucView 488 underlaget är stabilt i cellkultur för experiment som varar så länge som 36 timmar
- Media utbyte By långsam och lokal perfusion:
8. Live-cell imaging
- Klicka på den röda kanalen att visa transfekterade cellerna.
- Välj och spara ett tiotal bilder där det finns flera transfekterade celler, och spara dessa "XY skede punkter". Beroende på mängden av datorns minne, kan du vara begränsat till det antal steg poäng som du kommer att kunna förvärva.
- Har bilderna mikroskop fånga (i ljusa fält, röd kanal och grön kanal) på dessa sparade skede poäng varje 6 minuter.
- Alla gröna fläckar som syns under de tidiga stadierna av experimenten tyder sannolikt celler som redan genomgår apoptos, på grund vanligtvis transfektion och / eller miljömässiga stress. ApoptOsis på grund av den experimentella behandlingar kommer att upptäckas vid ett senare tidpunkterna i försöket.
9. Statistisk analys
För varje experiment program vi mikroskop för att förvärva flera XY poäng för att samla in en stor datamängd effektivt. Varje experiment utförs i två eller tre exemplar och data sammanställs från olika experiment som utförs på olika dagar. Från varje uppsättning data, analyserar vi upp till 15 synfält och jämföra förhållandet mellan caspase-negativa celler för caspase-positiva celler (totalt antal celler i synfältet / totala antalet caspase-positiva celler).
- De inspelade mätningar från varje datamängd är grupperade i ett större prov uppsättning och jämförs sedan med varandra med hjälp av en ANOVA tabell (p = 0,05). Vi visar medelfel för medelvärdet (SEM) för varje experiment, och jämför sedan skillnaden i medel genom att utföra ett Tukey test betyder jämförelse (p = 0,05) för att avgöra which behandlingar skiljer sig betydligt från varandra.
10. Representativa resultat
Vi har beskrivit ett experiment för att illustrera hur NucView 488 substrat kan tyda på en ökad frekvens av apoptos av N19-OLG cellkulturer efter en behandling med en hög extracellulärt kalium koncentration. Den N19-celler låg transfekterade med RFP, och som antingen behandlades med 3 mikroliter NucView 488 substrat (kontroll), eller 3 mikroliter NucView 488 substrat och 80 mm [K +] (behandling). Celler övervakades och bilder förvärvades under en 12 timmar tidsförloppet, vilket är tillräckligt för studier med neurologiska förolämpningar (Figur 1A). I kontroll förhållanden, vi följer inte stora mängder av apoptos jämfört med 80 mm [K +] behandlas kulturer (hashed box), som visade cirka 45 dödsfall% cellen efter 12 h (Figur 1B). Bakgrunden grön signal observerad i kontrollen förhållanden indikerar celler som genomgår apoptos utan tillsats av extracellulärt kalium. Praktiskt taget ingen av cellerna i kontroll experiment utställningen apoptos av 12 timmar tidpunkt, men i andra situationer experimenten kan krävas för att på längre sikt. Bilderna har förvärvats med hjälp av en 10x mål. Bar = 100 ìm.
Figur 1. (A) en 12 h Tid experimentet N19 OLG kulturer 48 timmar efter transfektion uttrycker RFP-MBP (röd kanal) tillsammans med 3 mikroliter av NucView 488 substrat (grön kanal). Kulturer var antingen behandlades med en slutlig koncentration av 80 mm [K +] (vänster paneler), eller ingen behandling som en kontroll (höger sida). Bilder förvärvades till 6 min mellanrum, och betydande aktivering av klyvs caspase-3 (grön signal) kan observeradi kulturer behandlas med 80 mm [K +] i cellkärnan (hash ruta) jämfört med kontrollgruppen experimentet. (B) Andel klyvs caspase-3 celler (beräknas genom att dividera det totala antalet celler i synfältet genom att det totala antalet caspase-positiva celler). I jämförelse med kontroll förhållanden, observerade vi runt 45% celldöd efter K +-behandling med 12 h.
SVideo 1. En 12 tim Tid experiment av N19-OLG kulturer 48 timmar efter transfektion uttrycker RFP-MBP (röd kanal) med 3 mikroliter av NucView 488 substrat (grön kanal), tillsammans med ljusa-fält bilder och en trevägs samman bild, efter behandling med 80 mm [K +].
svideo 2. En 12 tim Tid experiment av N19-OLG kulturer 48 timmar efter transfektion uttrycker RFP-MBP (röd kanal) med 3 mikroliter av NucView 488 substrat (grön kanal), tillsammans med ljusa fält imagES och en tre-vägs samman bilden. Ingen behandling har tillämpats på kulturer och N19-OLGs kan ses vandrar genom mikroskopfält i motsats till cellkulturer som behandlats med 80 mm [K +] (jämför med svideo 1).
Discussion
Även om detta inte är den enda fluorogenic produkten tillgänglig för apoptos upptäckt, det finns flera betydande fördelar med att använda NucView 488 underlaget. En av de största fördelarna är möjligheten att följa apoptos i levande celler i realtid, medan de flesta alternativa produkter antingen kräva cellslys eller har dålig cell permeabilitet. Andra fördelar är hög känslighet för caspase-3 erkännande, hög cell permeabilitet, låg cytotoxicitet, och ingen påverkan på utvecklingen av apoptos. Underlaget har också låg bakgrundsfluorescens tills den klyvs och går in i kärnan, vilket eliminerar bakgrundsfluorescens. Den caspase-3 erkännande sekvensen innehåller 3 negativa laddningar och DNA-bindande färgämnet har en positiv laddning 2. Den DEVD-NucView 488 molekyl har alltså ett netto negativ laddning, vilket förhindrar aktivering och bindning av färgen till DNA i celler där caspase är inte aktiv.
Maintaining överensstämmelse mellan experiment behövs för att kunna dra meningsfulla jämförelser mellan replikat. En av de viktigaste parametrarna för att hålla konsekvent är celltäthet, eftersom det påverkar graden av transfektion. Att få höga transfektion priser på förevigat N19-OLG cellkulturer är svårare än med andra vanliga cellinjer som HeLa eller HEK293, och är starkt beroende av densiteten, enligt vår erfarenhet 12, 13. Vårt bästa transfektion effektivitet för dessa celler har erhållits med Fugene HD (Roche) och är normalt ca 15%, men kan nå över 30%, beroende på konstruktion. Noggrann celltalet kommer stöd att få konsekventa transfektion priser. Det är också viktigt att exponera celler från olika behandlingar till samma grad av miljöbelastning, särskilt när man mäter andelen apoptos. Specifikt den tid under vilken cellerna utsätts för transfektion reagens, eller mängden ljus exponering, är viktiga miljöfrågor Varikundfordringar att överväga, och bör förbli konstant över experiment. För våra applikationer, har vi funnit att samla ett stort antal områden-of-view ger ett tillräckligt stort urval storlek att göra statistiskt signifikanta jämförelser [ibid].
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Detta laboratorium har stötts av den kanadensiska Institutes of Health Research, till naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada, och multipel skleros Society of Canada (MSSC). GSTS var mottagare av en doktorand från MSSC. Vi är tacksamma att Dr Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) för många hjälpsamma diskussioner och kommentarer på detta manuskript. Vi är tacksamma för Biotium för deras generösa gåva av ytterligare NucView 488 caspase-3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium, Inc. | 30029 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Roche Group | 04709705001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO, by Life Technologies | 31053-028 | |
| 0.25% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 15050-065 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 12483-020 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| #1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 | |
Chamlide CMB magnetic culture chamber for 25 mm coverslip |
Quorum Technologies | CM-B-40 | |
| Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR international | 82050-576 | |
| BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR international | CA62406-161 | |
References
- Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening. J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).
- Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells. FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).
- de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. Caspase activation precedes and leads to tangles. Nature. 464, 1201-1204 (2010).
- Eldadah, B. A., Faden, A. I. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).
- Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation. Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).
- Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins. Glia. 58, 1292-1303 (2010).
- Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).
- Lau, A., Tymianski, M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration. Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).
- Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo. J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).
- Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells. J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).
- Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M.
- Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).
- Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms. J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).
- Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nat. Med. 5, 943-946 (1999).
- Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus. J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).
- Yu, S. P. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).
