Summary
هذا البروتوكول يوضح الأساليب المستخدمة في تهيئة بيئات 2D و 3D في غرف electrotactic مصمم خصيصا، والتي يمكن تعقب الخلايا
Abstract
الحقول الكهربائية الذاتية (EFS) بشكل طبيعي في الجسم الحي، وتلعب دورا حاسما خلال الأنسجة / جهاز تنمية والتجديد، بما في ذلك من 1،2 الجهاز العصبي المركزي. يتم إنشاء هذه الأجزاء التماثلية الصور الذاتية عن طريق التنظيم الخلوي للنقل الأيونية جنبا إلى جنب مع المقاومة الكهربائية من الخلايا والأنسجة. فقد أفيد أن التطبيقية EF العلاج يمكن أن يشجع على إصلاح وظيفي من إصابات في النخاع الشوكي في الحيوانات والبشر 3،4. على وجه الخصوص، وقد تجلى EF الموجه هجرة الخلية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 5،6، بما في ذلك الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) 7،8. تطبيق مباشر الأجزاء التماثلية الصور (DC) الحالية ليست تقنية متاحة عادة في معظم المختبرات. وقد وصفت نحن بروتوكولات مفصلة لتطبيق الأجزاء التماثلية الصور DC إلى الخلايا والأنسجة الثقافات 5،11 سابقا. هنا نقدم تظاهرة الفيديو من الأساليب القياسية استنادا إلى قوة الحقل المحسوب لاقامة 2D 1د بيئات 3D لاللجان التحضيرية الوطنية، والتحقيق في الاستجابات الخلوية لتحفيز EF في كل الظروف نمو الخلايا واحد في 2D، وعضوي النمط شريحة الحبل الشوكي في 3D. وcordslice الشوكي هو نسيج المتلقي المثالي لدراسة السلوكيات مجلس الوطنى المجراة سابقا، في مرحلة ما بعد زراعة الأعضاء، لأنه يتم الحفاظ عليها بشكل جيد في تنظيم أنسجة التهندس الخلوي ضمن هذه الثقافات 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا النموذج الحي السابقين يسمح أيضا الإجراءات التي لم تكن ممكنة من الناحية التقنية لتعقب الخلايا في الجسم الحي باستخدام الوقت الفاصل بين تسجيل على مستوى خلية واحدة. من الضروري للغاية لتقييم السلوكيات خلية في بيئة ليس فقط 2D، ولكن أيضا في حالة من عضوي النمط 3D التي mimicks على البيئة في الجسم الحي. وسوف يسمح هذا النظام عالية الدقة التصوير باستخدام غطاء زجاجي على أساس الأطباق في الأنسجة أو ثقافة الجهاز مع تتبع 3D الهجرة خلية واحدة في المختبر، والمجراة سابقا ويمكن أن تكون خطوة وسيطة قبل الانتقال الى السادسنماذج فو.
Protocol
1. العصبية العزلة السلف الخلية
- تشريح دماغ كامل من E14-16 الفئران والمتوسطة في مكان بارد DMEM/F12 القاعدية. إزالة جميع السحايا تحت مجهر تشريحي والعقول نقل في طبق بيتري 35 ملم.
- استخدام ملقط غرامة على فصل ميكانيكيا العقول إلى أجزاء الأنسجة ونقلها إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي ثم العينات في 800 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لإزالة الأنقاض.
- إضافة DMEM/F12 bFGF والتي تحتوي على صندوق تعديل العولمة الأوروبي ويسحن مع ماصة 1 مل.
- تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية للحصول على تعليق خلية واحدة.
- لوحة الخلايا في قوارير في 2-5 X 10 4 خلية / مل، ثم نفذ وسيلة تغيير كامل في كل 3 أيام، ومرور الخلايا كل 6 أيام.
- بعد لا يقل عن 5 فقرات، هضم neurospheres إلى الخلايا واحد باستخدام التربسين وEDTA وتنمو في غرف electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (أعدت على النحو المبين أدناه في 2). استخدام المتوسطة المتنامية التي تحتوي على N2، الملحق،bFGF وEGF في جميع الأوقات للحفاظ على خصائص الشخصيات.
2. إعداد غرفة electrotactic
- إعداد 22 × 11 مم من شرائح الزجاج بقسمة تعقم 22 × 22 مم سمك coverslips NO.1 في نصف باستخدام قلم الماس.
- إنشاء زجاج قائمة بذاتها تماما من الأبعاد الداخلية 22 × 10 ملم من قبل الإلتصاق معا أربعة يقف عموديا 22 × 11 مم مع شرائح سيليكون الشحوم عالية فراغ. السماح للآبار حتى يجف تماما وتتصلب بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، ونعلق 2 22 × 11 ملم الزجاج الشرائط، وموازية لبعضها البعض مما يترك فجوة من 10 ملم، على قاعدة طبق ثقافة 100 ملم باستخدام الشحوم سيليكون. اغلاق المنطقة بين هذه الشرائط من خلال وضع 22 × 22 ملم الغطاء زلة في كل نهاية، تعلق على الجزء السفلي من الطبق مع الشحوم من ثلاث جهات، ولكن ليس أن الأقرب إلى مركز.
- وضع زجاج إعدادا جيدا في الخطوة 2.2 على غطاء ينزلق حتى الجدران الداخلية خلق مساحة محصورة لبذرالخلايا على الجزء السفلي من لوحة. المياه واقية من جميع المفاصل مع الشحوم سيليكون. معطف هذه المنطقة المحصورة بالتتابع مع laminin ثم بولي-D-يسين: إضافة 1 مل بولي-D-يسين الى داخل القاعة ويترك لمدة 5 دقائق للسماح للبولي-D-يسين لربط الجزء السفلي من لوحة؛ غسل الغرفة مع برنامج تلفزيوني العقيمة مرتين، ثم تمييع laminin في برنامج تلفزيوني العقيمة لانتاج 20 ميكروغرام / مل واستخدامها لتغطية الجزء السفلي من لوحة. ترك في درجة حرارة الغرفة خلال الليل.
- في اليوم التالي، وخلايا الحصاد وإعداد 1 مل من تعليق تحتوي على 1 × 104 خلايا. إزالة laminin من الزجاج أيضا، مما يسمح للهواء جاف تماما، واستبدالها مع 1 مل من تعليق خلية. وضع الطبق في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات للسماح للمرفق.
- مرة واحدة في الخلايا هي متكدسة بما فيه الكفاية إزالة جميع متوسطة من الغرفة. إزالة بعناية الزجاج جيدا. يشكل وجود سقف فوق الخلايا عن طريق ربط بعناية، مع الشحوم سيليكون، وهو مشبع 22 × 22 ملم الزجاج ساترةسد بين الاثنين 22 × 11 مم الشرائط. تغطي الخلايا مع بضع قطرات من المتوسط لتجنب الجفاف.
- تشكل خزان متوسط معزولة في نهاية كل من الغرفة عن طريق خلق 2 الشحوم سيليكون حواجز للماء التي تعمل من حافة واحدة من الطبق إلى أخرى، وعلى سقف الغرفة. تملأ الغرفة مع متوسط الطازجة، وضمان التدفق من خلال الخزان المتوسطة من واحدة إلى أخرى. إعادة الإناء إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة للسماح لاسترداد الخلية.
3. تطبيق مجال كهربائي إلى الدائرة electrotactic
- يعد غطاء لتغطية صحن من خلال حفر اثنين من الثقوب، واحد وضعه فوق كل خزان للغرفة الهجرة.
- استبدال جميع المتوسطة في غرفة مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 25 العازلة HEPES ملم ونقل طبق على نظام التصوير التحكم في درجة حرارته. إعداد المعلمات التجريبية للمضي الوقت وتسجيل موقف متعددة. محاذاة غرفة بحيث الكاثود والأنود وعلى اليسار واليمين على التوالي، للتأكد من أن ناقلات EF يمتد أفقيا ينظر إلى أسفل المجهر وتسجيلها في نظام التصوير.
- 2 ملء الأكواب مع حل شتاينبرغ في (58 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.67 ملي بوكل، 0.44 ملي الكالسيوم (لا 3) 2 0.4 H 2 0، 1.3 ملي MgSO 4 0.7 H 2 0 و 4.6 ملم قاعدة Trizma، ودرجة الحموضة 7.4). ربط دورق منفصل لكل خزان المتوسطة باستخدام الجسور زجاج معدة سلفا (أنابيب زجاجية ~ 13 سم طويلة و~ 3 مم في القطر، وعقدوا العزم في شكل-U عن طريق التسخين في لهب بنسن)، مليئة 2٪ (ث / ت) Steinberg's-أجار حل، ويمر من خلال الفتحات الموجودة في غطاء. استكمال الدائرة الكهربائية عن طريق وضع جي / أجكل أقطاب موصلة بمصدر التيار المستمر في كل كوب من حل لشتاينبرغ.
- مجموعة الاتصال الهاتفي الجهد على إمدادات الطاقة إلى 0 والتبديل في. قياس الجهد عبر غرفة electrotactic في حين تحول حتى الاتصال الهاتفي الجهد، وذلك باستخدام مقياس الجهد، وتعديل لتتناسب مع متطلبات التجريبية.
- بدء تسجيل مرور الزمن. إجراء تغيير المتوسطة وتعديل التيار الكهربائي، كما هو مطلوب، في كل ساعة. ويمكن إضافة المتوسطة الطازجة، والمخدرات، أو العوامل الكيميائية إلى الخزانات على النحو المطلوب. عندما تغير اداء متوسط، يمكن اعتبار خياران على النحو التالي:
- NO.1 خيار - لإيقاف التسجيل مؤقتا مرور الزمن، وإزالة بعناية الجسور الزجاجية من غرفة لتجنب احداث بلبلة غطاء الغطاء، واستخدام معقم ماصة باستير بلطف استبدال جميع المتوسطة مع المتوسطة الطازجة ووضع الجسور والزجاج الخلفي، ثم استئناف عملية التسجيل.
- NO.2 الخيار - بدلا من ذلك، جعل العرف غطاء الغطاء مع 4 فتحات (2 وضعه فوق كل خزان للغرفة الهجرة) يمكن أن تستخدم أيضا لغرض التغيير المتوسطة. اثنين من الجسور لربط الزجاج، والاثنان الآخران لتغيير المتوسطة. الخيار 2 يسمح التسجيل المتواصل دون تدخل خلال تغيير المتوسطة.
4. إعداد شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط
- تشريح lumbالحبال AR الشوكي من 2 BL الاسبوع C57 القديمة / 6 الفئران.
- شريحة النخاع الشوكي إلى أجزاء ميكرون سميكة مع 500 مروحية الأنسجة McIlwain.
- شرائح منفصلة تحت مجهر تشريحي وحدد شرائح سليمة مع سهمي / هيكل محوري في الحبل الشوكي.
- شرائح لوحة في طبق بيتري 35 ملم تحتوي على 30 Matrigel ميكرولتر ووضعها أقرب إلى مركز ممكن، والحفاظ عليها في حاضنة 5٪ CO 2 في 37 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة حتى البروتينات Matrigel الذاتي تجميع لإنتاج طبقة رقيقة تغطي سطح شريحة الحبل الشوكي. من المهم جدا للتأكد من أنه قد تم تجميعها Matrigel تماما، واحتضان طبق بيتري في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إذا لزم الأمر.
- إضافة 4-6 مل DMEM/F-12 المتوسطة التي تحتوي على 25 العازلة HEPES ملم و15-20٪ مصل العجل الجنين بلطف جدا وذلك لتجنب تدفق المتوسطة مباشرة على شريحة. ضمان عدم شريحة غارقة تماما في المتوسط، وترك على سطح explants تتعرض بشكل جيد للفي الهواء. تغيير متوسطة مرتين أسبوعيا.
5. حقن من الشخصيات 33342 هويشت المسمى في شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط
- إعداد تعليق مجلس الشعب في 1 × 10 6 خلية / ميكروليتر.
- قبل احتضان تعليق خلية في المتوسط مع 5 ميكرون هويشت 33342 لمدة 30 دقيقة.
- استخدام أنبوب شعري من الزجاج على microinject 2 ميكرولتر من تعليق إلى شريحة الحبل الشوكي ببطء تحت المجهر. تأكد الشعرية أنبوب زجاجي يمر عبر matrigel (الجزء الوردي تحت المجهر)، وتصل إلى داخل شريحة الحبل الشوكي (نسيج رمادي تحت المجهر)، ويبقى داخل شريحة الحبل الشوكي ما لا يقل عن 30 ثانية لتجنب تعليق خلية دهس. وضع طبق بتري تحتوي على شريحة الحبل الشوكي في الحاضنة (37 درجة مئوية 5٪ CO 2) وتترك طوال الليل.
- اليوم التالي، وتطبيق EF من 500 MV / مم الى شريحة تحتوي على النخاع الشوكي هويشت 33342 ذات العلامات الشخصيات في غرفة electrotactic (باستخدام الأساليب المذكورة في3).
6. ممثل النتائج
عندما تعرضت اللجان التحضيرية الوطنية إلى مجموعة من الأجزاء التماثلية الصور الفسيولوجية أظهروا الموجهة للغاية هجرة الخلية نحو القطب السالب (الشكل 1). وأشير أيضا إلى الملاحظة نفسها على مستوى خلية واحدة على عضوي النمط شريحة الحبل الشوكي نموذج الجسم الحي السابقين، وهو محاكاة بيئة 3D في ظروف فيفو (الشكل 2).
الشكل 1. الشخصيات تظهر هجرة موجهة في الأجزاء التماثلية الصور. وأظهرت أجهزة الهجرة الموجهة نحو القطب السالب للغاية عندما تتعرض لنظام تشفير الملفات، الخطوط الحمراء والأسهم الزرقاء تمثل مسارات واتجاه حركة الخلية (A). (ب) ويبين مسارات هجرة من الشخصيات. شريط: 50 ميكرون.
الشكل 2. الشخصيات المزروع تظهر هجرة موجهة نحو القطب السالب في شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستند البروتوكولات التي نستخدمها في الدراسات السابقة 5،11. يمكن الحفاظ على الأوضاع الحالية باستخدام هذه الأساليب، ثقافة مستقرة والكهربائية في حين بتطبيق EF عبر الجسور أجار، حل شتاينبرغ، والأقطاب الكهربائية AG / أجكل، إلى خلايا أو شرائح تربيتها في غرف electrotactic مصمم خصيصا من أبعاد موحدة ودقيقة. ويمكن تعديل عمق الغرف لاستيعاب لعينة مختلفة سمك 11، وذلك في حالة من الخلايا، ويمكن تعديل حجم غرفة لاستيعاب لكن هناك حاجة العديد من الخلايا (على سبيل المثال تحليل لطخة غربية يتطلب العديد من الخلايا). عدلت نحن وتطوير هذه الأساليب للسماح للإجراءات التي ليست ممكنة من الناحية التقنية لتعقب الخلايا في الجسم الحي باستخدام الوقت الفاصل بين تسجيل على مستوى خلية واحدة. وقد أجريت غالبية الأبحاث السابقة بشأن الاستجابات الخلوية إلى نظام تشفير الملفات، في بيئات 2D. في الدراسة المجراة من الاستجابة electrotactic من الشخصيات على مستوى خلية واحدةمن شأنه أن يوفر أدلة محوري لإثبات أي صلة الفسيولوجية. ومع ذلك، هذا من الناحية الفنية من الصعب جدا تحقيق مع التكنولوجيا الحالية، وخصوصا عندما تحاول الحصول على الوقت الحقيقي وتسجيلات الهجرة الخلية. لقد اتخذنا المزيد من الخطوات لإنشاء فيفو عضوي النمط السابق شريحة الحبل الشوكي نموذج الثقافة، ومحاكاة عن كثب في بيئة الجسم الحي، مما يدل على أن الخلايا لا تزال تمتلك استجابة electrotactic في بيئة 3D، كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن أيضا أن تكون هذه الطريقة مناسبة لرصد آثار من الأجزاء التماثلية الصور في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في بيئة 3D عضوي النمط، مثل التئام الجروح في الأنسجة الظهارية، الأوعية الدموية في الشريان الأورطي أو خاتم CAM الفرخ، والتأثيرات الجينية وربما في جنين الفرخ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المنحة الملكية URF المجتمع UF051616، المملكة المتحدة، ومجلس البحوث الأوروبي STG منحة 243261 إلى BS. كما يدعم العمل في مختبر MZ من معهد كاليفورنيا للالتجدد الطب منحة RB1-01417.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
