2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

Summary

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています

Abstract

内因性電界（EFS）は、生体内で自然に発生し、中枢神経系の^1,2のことを含め、組織/臓器の開発と再生時に重要な役割を果たしている。これらの内因性排出係数は、細胞や組織の電気抵抗と組み合わせてイオン輸送の細胞調節によって生成されます。それが適用され、EF治療は、動物およびヒトにおける^{3,4 -}脊髄損傷の機能的な修復を促進することが報告されている。特に、EF主導細胞遊走は、神経前駆細胞（NPCに^）7,8を含む細胞の種類^5,6、多種多様な、で実証されている。直流（DC）排出係数の適用は、ほとんどの研究室で一般的に使用可能なテクニックではありません。我々は以前^5,11細胞や組織文化へのDCの排出係数の適用のための詳細なプロトコルを記述している。ここでは2Dを設定するには、計算された電界強度に基づいて、標準的な方法のデモビデオを提示dは3DはNPCのための環境、および2Dの単一細胞の成長条件、および3Dの器官脊髄スライスの両方でEFの刺激に対する細胞応答を調査する。 cytoarchitectonic組織の組織が ​​十分にこれらの培養^9,10内に保存されているため、脊髄cordsliceは、移植後、NPC ex vivoでの動作を研究するための理想的な受信者の組織である。さらに、このex vivoでのモデルはまた、単一細胞レベルでの経時的記録を用いたin vivo で細胞を追跡することは技術的に可能ではありません手順をすることができます。それは、2D環境ではないだけでなく、 生体内環境では真似の3D器官の状態で細胞の挙動を評価することが決定的に重要である。このシステムは 、in vitro 及び ex vivo における単一細胞遊走の3Dトラッキングと組織又は器官培養にカバーガラスベースディッシュを用いた高分解能イメージングを可能にし、viで上に移動する前の中間ステップことができますVOのパラダイム。

Protocol

1。神経前駆細胞の分離

1. E14-16マウスと冷たいDMEM/F12培地の場所から全体の脳を解剖する。 35ミリメートルのペトリ皿に解剖顕微鏡および転送の脳の下にあるすべての髄膜を除去します。
2. 機械的に組織の断片に脳を分離し、15 mlのチューブにそれらを転送するために微細な鉗子を使用し、破片を除去するために3分間800rpmでサンプルを遠心します。
3. DMEM/F12含むbFGFおよびEGFを追加し、1 mlのピ​​ペットでひいて粉にする。
4. 単一の細胞懸濁液を得るために、セルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。
5. 2から5×10 ⁴細胞/ mlのフラスコに細胞をプレートしてから、6日毎3日ごとに、通路の細胞を完全培地の変更を実行します。
6. 少なくとも5つの継代後、ダイジェストは単一の神経細胞にトリプシンとEDTAを使用してpoly-D-lysine/laminin-coated electrotactic室（2に後述するように調製した）上に成長。 、N2-サプリメントを含む成長培地を使用します。bFGFおよびEGFはすべての回でNPCの特性を維持します。

2。 electrotactic室の準備

1. ダイヤモンドペンを使用して半分にオートクレーブ処理22×22ミリメートルNo.1の厚さのカバーを割ってガラスの22×11ミリメートルストリップを準備します。
2. 接着でよくインテリア寸法22×10 mmの自立ガラスを作成します。一緒に4垂直に高真空用シリコーングリースを持つ22×11ミリメートルストリップを立っている。井戸は完全に一晩乾燥し、硬化することができます。
3. 次の日、シリコーングリースを使用して、100 mmの培養皿の底に、10 mmのギャップを残して互いに平行に、2つの22×11 mmのガラス板を取り付けます。センターに最も近いことが三方にグリースを皿の底に取り付けられたそれぞれの端に22×22 mmのカバースリップを配置することにより、これらのストリップとの間の領域、ではなく、を封印。
4. カバー内部の壁はシードのために限られたスペースを作成するように、スリップの上にも、ステップ2.2で調製したガラスを配置しプレートの底に細胞。シリコーングリースの耐水すべての関節。その後順次、ポリ-D-リジンでコートこの狭い領域をラミニン：チャンバー内に1ミリリットルポリ-D-リジンを追加して、ポリ-D-リジンプレートの底にバインドできるようにするために5分間のままに、チャンバを洗う滅菌したPBSで2回、その後20μg/ mlを得、プレートの底をカバーするために使用する滅菌PBSにラミニンを薄める。一晩室温で残す。
5. 次の日、収穫細胞と1×104細胞を含む懸濁液1 mlを準備します。それは完全に乾燥空気、細胞懸濁液1ミリリットルに置き換えることができ、よくガラスからラミニンを削除します。添付ファイルを可能にするために4時間の最低37℃インキュベーターで皿を置きます。
6. 細胞が十分にコンフルエントになったらチャンバーからすべてのメディアを削除します。慎重によくガラスを削除します。シリコーングリース、オートクレーブ22×22 mmのカバーガラスで、慎重に取り付けることによって、細胞上の屋根を形成する2つの22×11 mmのストリップ間のブリッジ。乾燥を避けるために媒体の数滴を持つ細胞をカバーしています。
7. 室の屋根上の皿の一方の端から他に実行する2つの水密性シリコーングリースの障壁を作成することで、チャンバーの各端部に分離された媒体の貯水池を形成します。フロースルー1培地リザーバから他のを確保し、新鮮培地でチャンバーを記入してください。細胞の回復を可能にするために12時間インキュベーターに皿を返します。

3。 electrotactic室への電界の印加

1. 二つの穴は、移行室の各貯水池の上に配置1をドリルで皿を覆うように蓋を準備します。
2. 25mMのHEPES緩衝液を含む培地でチャンバー内にすべての媒体を交換して温度制御された撮像システムに皿を転送します。タイムラプス、マルチポジション記録のための実験パラメータを設定します。陰極と陽極であるように、チャンバーの位置を合わせますそれぞれ左右と上、EFベクトルが実行されるように水平に顕微鏡下に表示およびイメージングシステムに記録されます。
3. Steinberg社のソリューション（58 mM塩化ナトリウム、0.67 mMの塩化カリウム、0.44 mMのカルシウム（NO _{3）2·4H 2} 0、1.3 mMのMgSO _4を 0.7 H _{2 O}および4.6 mMのTrizma塩基、pH7.4）で2つのビーカーを記入してください。 2％（W ​​/で満たされた、あらかじめ用意したガラスの橋を（〜13センチ、直径〜3ミリメートルのガラス管と、ブンゼン炎で加熱することによりU字型に曲げ）を使用して、各媒体タンクに別々のビーカーを接続蓋の穴を通過v）のSteinberg's寒天ソリューションを提供しています。 Steinberg社のソリューションの各ビーカーに直流電源に接続されたAg / AgCl電極の電極を配置することによって電気回路を完成させます。
4. 0とに切り替えるには、電源の電圧、ダイヤルを設定します。電圧計を使用して、電圧、ダイヤルを回しながらelectrotactic室の両端の電圧を測定し、実験的な要件に合わせて調整します。
5. タイムラプス録画を開始します。培地交換を行い、時間ごと、必要に応じて、電圧を再調整します。必要に応じて新鮮な培地、薬物または化学物質は、貯水池に追加することができます。培地交換を実行するときに、2つのオプションは以下のように考えることができます。
   1. オプション1番 - 一時的に休止タイムラプス録画をするには、慎重に、カバーの蓋を乱す避けるために、チャンバーからガラスブリッジを削除するには、新鮮な培地にすべての媒体を交換して静かに滅菌パスツールピペットを使用して、ガラスの橋を元に戻し、次に録音を再開します。
   2. オプションNo.2は - あるいは、カスタムも培地交換の目的に使用することができる4つの穴（2は、移行室の各貯水池の上に配置）とカバーの蓋を作りました。ガラスのブリッジ接続用の2つ、他の2つのメディアを変更する。オプション2は、培地交換時の干渉を受けずに連続記録することができます。

4。器官脊髄スライスの準備

1. ラム解剖2週齢のC57 BL / 6マウスのAR脊髄。
2. マッキルウェーン組織チョッパで500μmの厚さのセクションに脊髄のスライス。
3. 独立した解剖顕微鏡下でスライスはそのまま軸/矢脊髄構造を持つスライスを選択します。
4. マトリゲルのタンパク質が生成するために自己集合するまで、30μlのマトリゲル、それらを配置するを含む35ミリメートルのペトリ皿のプレートスライスはできるだけ中心に近い、少なくとも30分間37℃5％CO ₂インキュベーター内で、それらを維持する脊髄スライスの表面を覆う薄膜。それは完全に、別の30分、必要に応じて37℃でペトリ皿をインキュベートマトリゲルが組み立てされていることを確認することが非常に重要です。
5. スライス上に直接メディアフローを回避するために、25mMのHEPES緩衝液と非常に穏やかになるように15から20パーセントのウシ胎児血清を含む4〜6ミリリットルDMEM/F-12培地を追加します。スライスが完全にウェルに露出した外植片の表面を残して、培地中に浸漬されていないことを確認空気。週2回培地を変更します。

5。器官、脊髄スライスにヘキスト33342というラベルの付いたNPCの注入

1. 1でNPC懸濁液を調製×10 ⁶細胞/μlの。
2. 30分間、5μMHoechst 33342で培地中の細胞懸濁液をプレインキュベートする。
3. 顕微鏡下で徐々に脊髄のスライスに懸濁液2μlを顕微注入するキャピラリーガラス管を使用しています。キャピラリーガラス管は、マトリゲル（顕微鏡下でピンク色の部分）を通過し、脊髄スライス（顕微鏡下で灰色の組織）の内部に到達していることを確認し、上で実行する細胞懸濁液を避けるために、少なくとも30秒間、脊髄スライスの内部に残る。インキュベーターに脊髄スライスを含むペトリ皿（37℃、5％CO _2）を入れ、一晩そのままにしておきます。
4. 次の日、に記載されているメソッドを使用してelectrotacticチャンバー内のヘキスト33342で標識されたNPCを（含まれている脊髄のスライスには500mV / mmのEFを適用する3）。

6。代表的な結果

NPCは、彼らが陰極に向かって非常に指示細胞遊走（図1）を示した生理的な排出係数の範囲にさらされたとき。同じ観測はまた器官脊髄スライスを ex vivoモデルの単一細胞レベル、 生体内条件下で模倣し、3D環境（図2）で行われた。

図1。 NPCには、EFSの指示への移行を示しています 。排出係数にさらされたときのPCは陰極に向かって非常に向け移行を示し、赤線と青の矢印は細胞運動の軌跡と方向（）を表しています。 Bは、NPCの移行パスを示しています。バー：50μmである。

図2。移植されたNPCは器官脊髄スライスのカソードに向け移行を示す

Discussion

我々が使用するプロトコルは、以前の研究^5,11に基づいています。標準化された寸法精度のカスタム設計electrotacticチャンバー内で培養した細胞またはスライスに、寒天橋、Steinberg社のソリューション、及びAg / AgCl電極電極を介してEFを適用しながら、これらのメソッドを使用して、安定した文化や電流条件を維持することができる。チャンバーの深さが異なるサンプルに対応するために調整することができます¹¹の厚さ、細胞の場合には、室の大きさは、しかし多くの細胞を収容するために変更することができます（例えば、ウェスタンブロット分析は、多くの細胞を必要とする）が必要です。我々は単一細胞レベルでの経時的記録を用いたin vivo で細胞を追跡することは技術的に可能ではありません手続きを可能にするためにこれらのメソッドを変更し、開発してきました。 EFSに対する細胞応答に関する先行研究の大半は、2D環境で実施されています。単一細胞レベルでのNPCのelectrotactic応答の in vivo研究では任意の生理学的関連性を立証する重要な証拠を提供するであろう。しかし、これはリアルタイムの細胞移動の記録を取得しようとする場合は特に、現在の技術で実現することは技術的には非常に困難です。我々は密接に図2に示すように、細胞はまだ3D環境でelectrotactic応答を持っていることを実証し、 生体内環境で模倣し、ex vivoでの器官脊髄のスライス培養モデルを確立するためにさらなる措置を講じている。このメソッドはまた、大動脈リングまたはひよこCAMの上皮組織の創傷治癒、血管新生として、器官3D環境内の細胞さまざまな種類の上で​​EFSの効果を観察に適していると、ニワトリ胚でおそらく遺伝的影響でした。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-basic Recombinant Human	Invitrogen	PHG0026	20 ng/mL
EGF Recombinant Human	Invitrogen	PHG0311	20 ng/mL
N2-Supplement (100X) liquid	Invitrogen	02048
DMEM/F12 medium (high glucose)	Invitrogen	31330-095
Poly-D-Lysine	EMD Millipore	A-003-E
Natural mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel)	BD Biosciences	354230
HEPES buffer	GIBCO, by Life Technologies	15630
McIlwain tissue chopper	The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd	TC752-PD
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554